Биотехнология, биопрепараты (вакцины, сывортки, прививки и т.д.)

Переливание крови.

Позднее создание искусственных органов (искусственная почка ...). - Выделение ферментов, использование иммобилизованных ферментов в молочном деле и пр. - Разработка получения МАТ (моноклональных антител) гибридом (Келлер и Мильштейн, 1975; Нобелевские лауреаты) - Разработка и применение биосенсоров - технических средств детектирования веществ (с помощью антител, ферментов, рецепторов...). Уже созданы биосенсоры более 100 веществ. /1990г./ _- Развитие генной инженерии .. Технология включения гена (инсулина и пр.) Е.coli. -- Использование микроорганизмов (бактерий, дрожжей, вирусов) как реципиентов чужеродного генетического материала для получение БАВ. Например, получены рекомбинантные штаммы Е.с., продуцирующие интерфероны, инсулин, гормон роста; В.subtilis, - вырабатывающие интерферон, инсулин; дрожжи - продуценты ИЛ, рекомбинантные вирусы осповакцины, синтезирующие антиген гепатита В. Производство лекарственных форм (интерлейкины, интерферон, тканевый активатор плазминогена, фактор VIII, эритропоэтин, релаксин, использующийся для расслабления шейки матки, гормон роста, фактор роста эпидермиса колониестимулирующие факторы, МАТ). В клиниках сегодня (1988г.) проходит испытания около 150 биотехнологических лекарств. - Разработка способов переноса генов (впрыскивание в яйцеклетку, электроток, вирусами, плазмидами). Некоторые методы переноса дают в результате не трансгенных животных, а химер . Для этого в эмбрион животного вводят группу эмбриональных клеток другого вида.

Получаемое потомство построено из 'мозаики' клеток, часть которых несет гены одного из родителей, а часть - другого. Так, широко известная сегодня 'ковца' (химера козы и овцы), выведенная в Кембридже (Англия), является такой химерой. От козы она унаследовала рога, а от овцы - лохматую шкуру. - В клетки молочных желез овец введены гены фактора IХ ССК (лечение гемофилии В), другим - альбумин (используется после хирургических операций). - В 1982г.

Ричарду Палмитеру и Ральфу Бринстеру удалось пересадить ген гормона роста крысы мышке. В итоге трансгенная мышь была в 1,5 раза большего размера, чем обычные. - Разработка автоматизированных синтезаторов гена.

Получение рекомбинантных ДНК. Разработка технологии репарации ДНК. С помощью ферментов рестрикции (их обнаружено более 400) разрезается кольцевая плазмида, вставляется новый участок ДНК. - Генноинженерные микробы (например, 'форсбан', защищающий растения от заморозков), семена и пр.

Рекомбинантные организмы попадают в окружающую среду (известно более 20 случаев). Негативные последствия не обнаружены. - Разработан способ усиления естественной способности бакуловирусов поражать насекомых-вредителей, введя в них гены ДНК, кодирующие яды. Если в вирусы встроить гены белков человека, то в организме хозяина (насекомого) они будут усиленно продуцировать данные белки. - Клонирование. - Технология гибридизации фрагментов ДНК и РНК, на основе которой разработаны различные методы ( ПЦР = полимеразная цепная реакция /Мюллис,1983/, лигазная цепная реакция, Q-бета-система и др.). - Созданная технология получения гомозиготных 'knockout'-мышей с отсутствием в их геноме тех или иных генов /Koller B.H.,1992/. _Использование микроорганизмов - из грибов для получения антибиотиков используются актиномицеты (род Streptomyces), Penicillium chrysogenum, Clphalosporum acremonium, Streptomyces spp и др. - дрожжи (в хлебопечении, пивоварении, виноделии, получении соков, кормового белка, питательный сред для выращивания бактерий и культур животных клеток); Из 500 известных видов дрожжей используется только несколько; - род Acetobacter для превращения этанола в уксусную кислоту и уксусной кислоты в газ; - род Bacillus - для получения ферментов (В.subtilis) -- средства защиты растений (В.thuringiensis); - род клостридий - для сбраживания сахаров в ацетон, бутанол; - молочно-кислые бактерии (lactobacillus,Leuconostoc,Streptococcus); - псевдомонады для получения витамина В 12 ; - коринебактерии glutamicum для получения аминокислот и др. БИОПРЕПАРАТЫ Классификация I. Биопрепараты, использующиеся in vivo 1. АГ-ые (вакцины /в т.ч. анатоксины/, аллергены, лизаты микробов для кожных проб), создающие активный иммунитет.

Специфические АТ и Тк появляются в кровотоке примерно через неделю у здорового человека (у лиц с ИД - позже). 2. АТ-содержащие (антисыворотки, гамма-глобулины, МАТ, иммунное молоко), создающие за счет готовых АТ пассивный иммунитет.

Однако 'примеси' данных биопрепаратов и ксеногенные (лошадиные и пр.) АТ запускают активный 'вредоносный' иммунитет.

Поэтому использование желательно в течение 1 недели после первой инъекции (до появления вторичных АТ и избежания ИК-ых осложнений, васкулитов). Антисыворотки вводят только по жизненным показаниям. 3. Иммунокорректоры - животного происхождения (цитомедины, интерлейкины, интерфероны, факторы роста, гормоны /глюкокортикоиды и др./) - растительного происхождения (аллергены, лектины) - микробного происхождения (БЦЖ, продигиозан, антибиотики) - химические иммунокорректоры 4. Бактериофаги.

Бактериофаги относятся к эффективным препаратам антимикробного действия, обладающим строгой специфичностью и не вызывающим развития дисбактериозов, как это имеет место при использовании антибиотиков. II. Биопрепараты, использующиеся in vitro - Диагностикумы (для РНГА) антигенов микробов (самих клеток, лизатов, или очищенных АГ-ов), использующиеся в серологических реакциях.

Иммунодиагностикумы - это часто взвесь известных убитых микробов. Для инактивации используют высокую температуру, химические вещества (формалин, спирт, ацетон, фенол), ультразвук, ультрафиолетовые и рентгеновские лучи. При выделении из клеток различных АГ используют методы разрушения, экстракции, обработку ферментами и различными детергентами, центрифугирование. /2551к/ - Антигены, в т.ч. анатоксины /токсины/ для проведения РП, РН (для постановки контроля в серологии). - Диагностические антисыворотки. Для удаления из антисывороток группоспецифических антител в сыворотку последовательно добавляют микроорганизмы, в состав которых входят групповые антигены (метод Кастеллани). Таким образом получают адсорбированные сыворотки, которые содержат антитела к определенному виду микробов. /2551к/ - МАТ (мышиные) для ИФА, иммуноблоттинга, ИФМ и пр. серологических реакций. АЛЛЕРГЕНЫ Известно более 200 тысяч аллергенов.

Аллергией страдает 20% населения земного шара. I. ЭНДОАЛЛЕРГЕНЫ - тепловые --- тепловая аллергия (на перегрев), - ожоговые белки ('аллергия на УФ'), - холодовые эндоаллергены (измененная конформация белков на холоду) --- холодовая аллергия, - появляющиеся новые антигенные детерминанты при физнагрузке ('аллергия на физнагрузку') - появляющиеся новые антигенные детерминанты при стрессе ('аллергия на стресс') II. ЭКЗОАЛЛЕРГЕНЫ 1) Растительного происхождения Официально зарегистрировано 600 (598) видов аллергических растений.

Поллинозы на пыльцу . Количество пыльцы в воздухе max ранним вечером и min утром, поэтому период активной деятельности надо перенести на утренние часы.

Пыльца деревьев: ива, ольха, тополь, лещина, береза, дуб, клен, ясень, рябина, вяз, липа, ильм.

Пыльца хвойных деревьев: сосна, лиственница, ель, пихта, кедр.

Пыльца злаков: овес, рожь, пшеница, пырей, рис, овсянница, ежа, амброзия, тимофеевка, мятлик; загрязняющие зерно продукты животного, токсического, химического характера (аллергия на пшеничную или овсяную муку). Растения, вызывающие фитодерматозы: крапива, середка тополя, волчье лыко, одуванчик, марь, паслен, лебеда, полынь. /7538/91/ Аллергены цитрусовых - какие-то белковые компоненты кожуры мандарин, лимонов, апельсин. Лук, клубника, малина, земляника, соя ... Чай, кофе, шоколад.

Ваниль, горчица, гвоздика, миндаль, корица, мускатный орех, чеснок, сельдерей, перец. 2) Животного происхождения - кожный эпителий животных (перья и пух птиц, 'шерсть' животных --- пуховые и шерстяные изделия) - корм для аквариумных рыбок (сухие рачки и дафнии) - экстракт тараканов - морские продукты, особенно богатые иодом - мед, яйца, рыба и икра, свинина, куриное мясо, - молоко (альфа-лактальбумин, казеин) - 7% аллергий у детей; У кипяченого молока аллергические свойства резко падают (меняется структура белков). Молоко заменяют кефиром, творогом и пр. Сыр. - яды насекомых - препараты крови, лечебные сыворотки. 3) микробного происхождения - Некоторые АГ пневмококков, стафилококков, стрептококков, - АГ дрожжей /аллергия на хлеб/, - АГ спор плесневых грибов - ГП (М. более 40 кД), - АГ паразитов - АГ вакцин - Антибиотики 4) химического происхождения - краски, лаки, моющие средства, косметика (только 20% косметических средств безопасны в отношении аллергии /1652к/), - лекарственные препараты (сульфаниламиды, новокаин, дикаин и др. анальгетики, анестетики /аспирин, анальгин/), [анальгетики - блокируют болевую чувствительность; анестетики - подавляют любой вид чувствительности] - отходы химического производства /профессиональные болезни/, - рентгеноконтрастные вещества - дезинфецирующие средства и пр. [5) физического происхождения (см. эндоаллергены).] 6) Промышленная, бытовая и библиотечная пыль . - клещ домашней пыли Проба на аллергены: за рубежом накладывают манжету на предплечье с 40 ячейками, в каждой их которых один из основных аллергенов. Через 1-2 сут оценивается зона покраснения и соответствующая ячейка. (У пожилых лиц пробы чаще отрицательные.) . АНТИТЕЛО-СОДЕРЖАЩИЕ БИОПРЕПАРАТЫ (вызывают пассивный иммунитет) АТ-содержащие биопрепараты включают антимикробные или антитоксические АТ и используются для лечения или диагностики.

Антисыворотки используют по жизненным показаниям с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заболевания). 1) Кровь, плазма (переливание). Сыворотки. _Антисыворотки .. 2) _Гамма-глобулины . (общие, направленного действия, получаемые либо после иммунизации, либо от лица, недавно перенесшего заболевание). 3) _МАТ . (пока только мышиные, человеческие гибридомы в настоящее время отсутствуют). 4) Иммунное молоко.

Сочетание парентеральной и диалетической иммунизации позволило получить _иммунное молоко ., содержащее антитела к вибрионам холеры и токсину, ЭПКП, протеям, шигеллам Зонне. В настоящее время наметились 2 тенденции в технологии изготовления препаратов иммунного молока - получение _лактосыво- _ роток или лактоглобулинов .. Лактосыворотка, в отличие от лактоглобулина, обладает большей буферной емкостью, содержит ингибиторы трипсина и химотрипсина, что в известной степени обеспечивает устойчивость белков коровьего молока к действию ферментов ЖКТ. Кроме того, некоторые белки лактосыворотки (лактопероксидаза, лактоферрин, лизоцим и др.) оказывают неспецифическое антимикробное действие и способы потенцировать защитный эффект специфических антител. /2114к/87/ - (ПОВТОР материала по ОКИ) _Получение антисыворотки из молока Молозиво центрифугируют при 20000 об./мин. 2 часа при 4 0 С, липидный слой отделяют (обезжиривание). Казеин осаждают титрованием 1Н уксусной кислотой до рН 4,6 с последующим центрифугированием в тех же условиях.

Используют надосадок, который диализируют в 0,01М растворе фосфатного буфера с рН 7,0. Для выделения очищенной фракции Ig A можно использовать ионообменную хроматографию (ИОХ) на ДЭАЭ-целлюлозе. /6737/ 5) Антиидиотипические АТ используют для запуска активного иммунитета, поэтому называют антиидиотипическими вакцинами (см. материал по вакцинам) _ Получение АТ .-содержащих препаратов I. От иммунизированных животных II. Из крови иммунных лиц (недавно выздоровевших) _Иммунизация животных селезенка мыши Кровь выделение Ретракция сгустка ПК, синтезирующих (40 минут, 37 о С) искомые АТ Сыворотка ПК+ (В-лимфоцит, (=антисыворотка) инфицированный ВЭБ --- лимфомная клетка) (Высаливание, + ПЭГ спиртовое осаждение, адсорбция) Гибридома --- активация клеток Гамма-фракция МАТ иммуноглобулинов ИФ, ФНО, ИЛ в питательной Аффинная хроматосреде графия (сорбция на комплекс 'АГноситель' Реакция на 'примеси' Моновалентные АТ 1. Иммунизация Первая иммунизация вызывает первичный ИО; вторая и последующие --- вторичный ИО. Многократную иммунизацию называют гипериммунизацией (--- гипериммунная сыворотка). Способы иммунизации животных: - в/кож. (объем до 100 мкл) --- региональные ЛУ - п/кож. (объем 1-30 мкл). При данном способе иммунизации антиген распространяется медленно, т.к. подкожная клетчатка не имеет развитых лимфатических протоков. - в/мыш. (0,5-8мл соответственно для мышей-кроликов) в область бедра; птицам в грудную мышцу. - в/бр. (2-30мл соответственно для мышей-кроликов); при этом животное опускается головой вниз; - в/в (1-10мл); если в боковую вену хвоста, то хвост предварительно опускается в стакан с горячей водой -55 о С; - интраназально (по каплям от 0,03 до 1 мл соответственно для мышей-кроликов); - оральное введение (0,3-5 мл): антиген смешивают с кормом и скармливают или в виде питья, можно через зонд --- в желудок. /7143/89/1 - per rectum Пример: Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и тщательно перемешивают.

Полученную эмульсию вводят внутрикожно по 0,1мл в 10 точек спины, расположенных по 5 в ряд на расстоянии 2 см по обе стороны от позвоночника. Общая доза иммуногена равна 10-100 мкг на кролика.

Иммунизируют 6 кроликов массой по 2 кг. Через 8-10 недель проводят пробное кровопускание. При удовлетворительном качестве антисыворотки последовательно проводят до 3 кровопусканий, после чего кроликам дают отдохнуть в течение 1 месяца и затем делают следующие кровопускания. При неудовлетворительном качестве антисыворотки проводят вторичную иммунизацию, используя половинную дозу иммуногена в неполном адъюванте Фрейнда.

Противоэнцефалитный иммуноглобулин получали из сывороток людей, проживающих в местах распространения данного заболевания, содержащих достаточно высокий уровень специфических противовирусных антител. /1430к/ 2. О чистка ( фракционирование ) и тестирование - Осаждение -- высаливанием (осаждение сульфатом натрия или сульфатом аммония) -- осаждение спиртом -- полиэтиленгликолем (ПЭГ) -- каприловой кислотой - ферментирование - диализ - адсорбция -- аффинной хроматографией -- выделение на белок А-сефарозе (FcR золотистого стафилококка) Силу антитоксических сывороток измеряют в международных единицах (МЕ) по способности нейтрализовать определенную дозу токсина. _Антисыворотки - Лечебные (используется только по - Профилактические жизненным показаниям) - Диагностические По специфичности различают - моновалентную антисыворотку - поливалентную антисыворотку - антицельную антисыворотку (против всех сывороточных белков - 36) _Недостатки антисывороток .: - Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни концентрировали, содержит набор различных антител.

Поэтому ее называют поликлональной. Лишь _небольшая часть антител . направлена _против специфичных антигенных детерминант .. - Иммуноглобулины антисывороток уже с открытыми углеводными компонентами, поэтому _быстрее выводятся из организма .. - Углеводные компоненты, переплетаясь между собой, приводят к спонтанной _агрегации белков . при длительном хранении, что способствует в кровотоке закупорке некоторого количества капилляров и активации системы комплемента по альтернативному пути. - ' _Примесные АТ .' дают многочисленные 'перекрестные' положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам по серодиагностике. - ' _Примесные АГ .'. Иные белки сыворотки могут содержать растворимые (сброшенные) антигены HLA, АВ, Rh, иные аллотипы антител и др., что иммунизирует реципиента. - Ксеногенные (лошадиные) сыворотки при повторном введении в организм могут вызывать _аллергические реакции . на чужеродный белок.

Поэтому необходима постановка _внутрикожной пробы . с сывороткой в разведении 1:100 в объеме 0,1 мл.

Введение антитоксической лошадиной сыворотки допустимо лишь в случае отсутствия выраженной кожной реакции в течение 20-30 минут. /1430к/ - Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо _заново иммунизировать . животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег. _Гамма-глобулины (преимущественно Ig G) Содержание антител в препаратах иммуноглобулинов человека: - АТ к токсинам (дифтерийному, столбнячному, пертуссигену) - Титры агглютинирующих АТ к штаммам возбудителей располагаются в следующем порядке (по убыванию) -- P. aeruqinosa -- S. sanguis, -- B. melaninogenicus, -- B. bronchisrptica, -- Veillonella, -- E. coli. Титры к E.c. очень низкие. /2384к/84/ Использование иммуноглобулинов для пассивной иммунизации /7330/87/ Пулированные Специфические Специфические Ig человека Ig человека лошадиные Ig Гуморальный ИД Гепатит В Ботулинум токсин Гепатит А Бешенство Дифтерийный токсин Корь Столбняк Змеиный яд Ветряная оспа Яд паука Натуральная оспа Black widow (коровья оспа) Rh изоиммунизация pertussis МАТ МАТ (моноклональные антитела) - АТ, полученные из одного клона культуры плазматических клеток. МАТ с запрограммированной специфичностью впервые получили аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Kohler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что в 1978 году им была присвоена Нобелевскую премию. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ, несколько тысяч гибридом, в т.ч. на 600 вирусных антигенов. _Получение а) В-лимфоциты + вирус Эпстайна-Барра --- клетки быстро перестают синтезировать АТ --- формируются опухолемые лимфомные клетки б) В-лимфоциты селезенки иммунизированной АГ-ом мыши + миеломная лимфоцитарная клетка + ПЭГ (полиэтиленгликоль) --- слияние клеток (одной на миллион) --- далее размножается лишь гибрид - гибридома (неограниченное размножение). В основу метода положен давно известный принцип гибридизации (слияния) соматических (неполовых) клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов.

Первые - плазмоцитомы (опухолевые плазмоциты) из линий, культивируемых в искусственных условиях, in vitro. Как и все злокачественные клетки они интенсивно размножаются без всякого внешнего стимула.

Другие клетки - иммунные лимфоциты. Они несут в себе способность синтезировать и выделять необходимые антитела.

Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих 'родителей'. Получение гибридом включает 6 основных этапов. 1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам антигена, против которого необходимо получать антитела. 2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностные мембраны и способствующий соединению клеток. 3. Отбор гибридов.

Клетки культивируют в среде, содержащей гипоксантин.

Плазмоциты погибают из-за отсутствия фермента, его разрушающего, а лимфоциты - просто потому, что не умеют долго поддерживать свое существование вне организма. 4. Скрининг, то есть отбор тех гибридных клеток, которые вырабатывают антитела против антигена, использованнного для иммунизации.

Антиген прикрепляют к какому-либо носителю, например, к пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный антиген обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридомы, а затем наносят меченые антитела против мышиных или крысиных гибридомных антител (их метят радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками). Иными словами, проводят анализ культуральной жидкости на присутствие антител к искомому антигену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на антигене, а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела. В результате метка соединится с антигеном на носителе и зафиксируется. 5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли на достаточном расстоянии друг от друга. Через несколько дней вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть гибридома.

Клетки колонии снова разводят и помещают на питательную среду, чтобы устроить новые колонии.

Клонирование повторяют 3-4 раза, после чего получается устойчивая и продуктивная линия клеток. 6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в искусственных условиях или непосредственно из животных, привитых гибридомными клетками (как и многие злокачественные опухоли, гибридому можно прививать). _Недостатки МАТ: 1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты _мыши- _ных . гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получения человеческих МАТ. 2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой и отсутствие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной молекуле антигена. ( _Неполные АТ . не образуют ПИК, нельзя использовать в РА /только Кумбса/, РП) 3. Возможность непредсказуемых перекрестных реакций с полифункциональными антигенными детерминантами.

Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ. _Преимущества МАТ: 1. Главная особенность МАТ - _чрезвычайная моноспецифичность (против одной антигенной детерминанты) и абсолютная однородность. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы.

Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. 2. Возможность многократного получения в течение длительного времени (воспроизводимость). _Неограниченное количество . получаемых антител. 3. МАТ предполагается использовать _в лечебных целях . в качестве целенаправленных носителей, в состав которых будут включены токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные препараты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапии опухолей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ против CD 4,8; через 13 суток вырабатывались АТ на введенные МАТ). /6815,6816/ _Достижения - наборы для диагностики СПИДа, гепатита, инфаркта и пр.; - производство 'центоксина' - МАТ, связывающих яды при сепсисе; - производство антиидиотипических антител, 'аналогичных' инсулину (регуляция рецепторного апппарата, замена инсулина); - использование МАТ к интерлейкинам и другим цитомединам для иммунокоррекции. МАТ Основные дифференцирвочные антигены (Номенклатура антигенов СВ от 1993г.) /7070,94;7273/94,6504/90,7293/ АГ,МАТ Распределение Функции CD1a,1b,1c Тимоциты, клетки Гомологичны HLA I класса gp49,45,43 Лангерганса (=ДК), (3 варианта a -цепи) = a -цепь часть В-лимфоцитов Маркер ранней фазы созревания. b -цепь b 2-микроглобулин _CD2 . gp50 Т-клетки, ЕКК, _Рецептор для ЭБ (эритоцитов барана) с/с Ig тимоциты, Т-лимфоцитов (LFA-2) большинство Принимает участие в неспецифической тромбоцитов, активации ранних тимоцитов (до на моноцитах /?/ появления антигенных рецепторов). _CD3 . 20кД Т-клетки Часть рецепторного комплекса для с/с Ig-? зрелые антигенов. _(СD3+,CD56-) - маркер Т-лимфоцитов _CD4 . 59 кД _Т-хелперы ., Взаимодействие с HLA II класса, с/с Ig моноциты, ВИЧ-рецептор (2/3 периферических (Гены относятся к суперсемейству Т-лимфоцитов) генов иммуноглобулинов) CD5 gp67 Т-,часть В-клеток ? CD6 gp100 - ' -,тимоциты ? _CD7 . gp40 Т-клетки,тимоциты Рецептор для иммуноглобулина М Первый антиген протимоцитов (Критерий диагностики острых Т-клеточных лейкозов) _CD8 . 32/22 _Т-киллеры ., Взаимодействие с HLA I класса с/с Ig _Т-супрессоры . (рецептор HLA I) (на 1/3 перифериГены внеклеточных 2 доменов ческих лимфоцитов) гомологичны генам дометов Ig. CD9 gp 24 Моноциты,пре-В-клетки ? тромбоциты CD10 100 Пре-В-клетки,грануНейтральная эндопептидаза. лоциты, лимфоидные Антиген, выявляемый при острой предшественники лимфоцитарной лейкемии CD11а 180 Лейкоциты a -цепь LFA-1 (молекулы адгезии) CD11b 155 ЕКК,миелоидные CR3-рецептор (для С3bi), Мо-1, клетки, Т-subset a М-цепь интегрина СD 11b/18, моноциты,гранулоциты ICAM-1 CD11с 150 - ' - , СR4, a Х-цепь интегрина СD 11с/18 часть В-лимфоцитов СD13 150 Моноциты,гранулоциты Аминопептидаза N В присутствии МАТ к АГ происходит активация клеток CD14 - ' - Мо-2 CD16 50-65 Гранулоциты, ЕКК, Fc п R типа 3 (с низкой аффинностью) Т-subset,макрофаги СВw17 Гранулоциты, моноЛактозилцкрамид циты, тробоциты CD18 95 Лейкоциты b -субъединица (цепь) интегринов CD11а,b,с/CD18 = ICAM _CD19 . 95 _В-лимфоциты . sIg M-ассоциированная молекула _(маркер В-лимфоцитов) .1 _CD20 . 35 _В-лимфоциты . Антитела к CD20 вызывают пролиферацию клеток. _CD21 . 140 -'- СR2 (рецептор для С3d),рецептор для вируса Эпштейна-Барра CD23 ф 45 Активированные _Fc e R . II (низкоаффинный рецептор) В-клетки CD23 и 45 В-клетки,моноциты, - эозинофилы,Т-subset СD24 41/38 В-клетки, Костимуляция Т-хелперов-? гранулоциты _CD25 . 55 Активированные Ти Низко-аффинный _ IL-2-рецептор В-клетки,макрофаги ( b -цепь) CD29 120 Многие типы клеток b -1-цепь интегринов, GPIIa СВ31 140 Тромбоциты,моноциты, GPIIa гранулоциты,В-лимфоциты, (Т-лимфоциты) _CD34 . 105-120 Ранние предшественРецептор L-селектина (СD62L). ники гемопоэза _Маркер миелоидных и лимфоцитар .- _ных лейкозов. CD35 220 Гранулоциты,моноциCR1 (рецептор для С3в) ты,эритроциты,ДК, ТК,В-лимфоциты CD41 120/133 Клетки тромбоцитарGPIIb/IIIa,GPIIb ного ряда CD44 200/220 Лейкоциты, Pgp-1,рецептор гиалуроновой /180/190 эритроциты кислоты, HCAM gp 80-95 головной мозг Рецептор хоминга /7293/ _CD45 . 180-220 Лейкоциты Общий лейкоцитарный антиген (Семейство родственных ГП на лейкоцитах) Клетки CD4+/СD45+ идентифицированы как _индукторы супрессоров CD49a 210 Тромбоциты VLA-1, ( a 1-цепь интегринов) CD49b 160 Тромбоциты VLA-2, ( a 2-цепь интегринов),GPIa CD49c 125 Тромбоциты VLA-3, ( a 3-цепь интегринов) CD49d 150/ Моноциты,Т-лимфоVLA-4, ( a 4-цепь интегринов), 80/70 циты, тимоциты, рецептор для фибронектина, В-лимфоциты, рецептор VCAM (CD 106) клетки Лангерганса _CD49е . 135/ Тромбоциты VLA-5, ( a 5-цепь интегринов), 125 рецептор фибронектина CD49f 120/25 Тромбоциты VLA-6, ( a 6-цепь интегринов), Т-лимфоциты рецептор ламинина, GPIc CD50 121 Лейкоциты ICAM-3 CD51/61 Тромбоциты Рецептор витронектина, b 3-цепь 21-28 интегринов, GPIIIa CD54 90 Многие типы клеток ICAM-1 CD55 - ' - ФУР (DAF) - фактор, ускоряющий расщепление С3- и С5-конвертаз комплемента _CD 56 ........ Маркер ЕКК (СD56+ CD3-) CD58 40-65 LFA-3 Лейкоциты, лиганд CD2 CD62E 115 Эндотелиальные Е-селектин, ELAM-1, рецептор клетки CD15s CD62L 75-80 Предшественники L-селектин, LAM-1, LECAM-1 гемопоэза,лимфоциты, моноциты,гранулоциты CD62P 150 Активированные Р-селектин, PADGEM тромбоциты, эндотелиальные клетки СD64 75 Моноциты Рецептор Fc g IgG типа I (Fc g RI) CD71 Пролиферирующие Рецептор трансферрина gp90-95 клетки, моноциты, gp43/39 эритроидные предp69 шественники СВ73 p69 Ти В-клетки Экзо-5'-нуклеотидаза CD74 В-лимфоциты, HLA II-ассоциированная инвариантная gp41/35/33 моноциты цепь, LN2 CDw75 - Зрелые В-лимфоциты, a -2,6-сиалилтрансфраза, LN1 CD102 60 Многие типы клеток ICAM-2, рецептор CD 11a/18 CD106 Эндотелиальные VCAM-1, рецептор CD 49d/29 100/110 клетки CD107a 110 Тромбоциты LAMP-1 CD107b 120 - ' - LAMP-2 СDw116 75-85 Миелоидные предРецептор ГМ-КСФ шественники,моноциты, макрофаги _CDw119 . 90 ЕКК,Т-, В-лимфоциты Рецептор п -интерферона _CD120а . 55 Ти В-лимфоциты Рецептор для ФНО-55 кД _СD120b . 75 Ти В-лимфоциты Рецептор для ФНО-75 кД _CDw121a . 80 Т-лимфоциты Рецептор для IL-1 типа 1 (IL-1R1) CDw121b 68 Т-лимфоциты,грануРецептор для IL-1 типа 2 лоциты,предшест- (IL-1R2) венники гемопоэза _СD122 . 75 Активированные Рецептор IL-2-75кД (IL-2Rb) лимфоциты,моноциты, часть покоящихся Т-лимфоцитов CDw124 140 Лимфоциты,моноциты, Рецептор IL-4 (IL-4R) предшественники гемопоэза СD126 80 Т-лимфоциты,активиРецептор IL-6 (IL-6R) рованные В-лимфоциты, моноциты,тромбоциты, гранулоциты CDw127 75 Ти В-лимфоциты, Рецептор IL-7 (IL-7R) макрофаги CDw128 58/67 Гранулоциты Рецептор IL-8 (IL-8R) CDw130 130 Рецептор IL-6 (IL-6R) gp1300 sig Примание: LFA - лимфоцитарный функцио-ассоциированный АГ ДК - дендритные клетки КСФ - колониестимулирующий фактор ФНО - фактор некроза опухолей c/с Ig - cуперсемейство иммуноглобулинов ИММУНОПРОФИЛАКТИКА И ИММУНОТЕРАПИЯ Иммунопрофилактику и иммунотерапию инфекционных заболеваний проводят с помощью - вакцин, в т.ч. анатоксинов (препаратов индукции активного противоинфекционного иммунитета за счет мобилизации механизмов иммунологической памяти); - иммунных сывороток и иммуноглобулинов - препаратов, содержащих готовые специфические антитела, введение которых в организм приводит к немедленному приобретению пассивного гуморального иммунитета, /1430к/ - иммунокорригирующих средств (интерлейкинов, факторов роста, интерферонов, цитокинов). Анатоксины Анатоксины - препараты, содержащие инактивированный токсин, вырабатываемый микробом. (Токсины - экзои эндо /ЛПС Г-/). Эти препараты обеспечивают выработку иммунитета к токсину соответствующего возбудителя.

Используются вместе с адъювантом. _Примеры - Дифтерийный (АД) - Столбнячный (АС) - Сексанатоксин, тетраанатоксин (токсины возбудителей газовой гангрены) - Стафилококковый - Комбинированные препараты -- дифтерийно-столбнячный (АДС) -- коклюшно-дифтерийно-столбнячный (АКДС) _Приготовление . (выделение + адъювант) - Токсины получают путем фильтрования жидкой питательной среды или исследуемого материала. где размножались токсигенные бактерии.

Анатоксны получают путем обработки токсинов формалином (0,3% раствор /0,4%/) при температуре 37 о /39 о / в течение 30 дней. При этом токсин теряет токсические свойства, но сохраняет антигенные. - Эндотоксины Е.coli (О111:В4) выделяли 3 методами ( безводным фенолом , охлажденным бутанолом , и их смесью.

Гельфильтрация. ) /7661/79/ Адъюванты (adjuvans помогающий, поддерживающих) - компонент иммунизируемого препарата, необходимый 1) для более длительного сохранения в организме в месте введения; 2) для повышения иммуногенности, допустим, гаптена (полиионы) 3) Адъювант может быть с иммуностимулятором (БЦЖ, тималином, ГМ-КСФ /2648к/, HLA II /при иммунизации комплексом АГ с HLA II класса антигенность значительно повышается/ и др.); тогда он называется полным.

Например, адъювант Фрейнда (неполный = минеральное масло + эмульгатор; полный = минеральное масло + БЦЖ). Виды адъювантов 1. _Минеральные сорбенты и масла - Al(OH) 3 - гидрооксид (гидрат окиси) алюминия, который полиме- - ризует АГ. Следует учитывать, что алюминий вызывает слабобумие. - фосфат алюминия - алюминиево-калиевые квасцы - масляные адъюванты (оказывают побочное действие) /2112к/ Адсорбированные препараты, т.е. осажденные на коллоидных субстратах (гидрат окиси алюминия, фосфат алюминия), с одной стороны, с повышенной иммунологической эффективностью благодаря созданию в организме 'депо' в месте инъекции, а с другой стороны, с усиленной иммунологическая реактивность организма (адъювантное действие сорбента. (Л Т.А. ) 2. Микробного происхождения. - Целые _бактериальные клетки . -- вакцина БЦЖ, -- Bordetella pertussis, -- Сor.parvum-?х - извлеченные из микробов химические вещества -- ЛПС, липид А ЛПС-да или эндотоксин E.coli /7958/, -- ГП /1338к-с.253/, -- Пептидоглюкан клебсиелл. /2295к/ -- Холерный токсин в микродозах (в мукозальных вакцинах). Используют субъединицу В молекулы холерного токсина, обеспечивающего рецепцию холерного токсина на клетках.

Токсин обладает иммуномодулирующей активностью: активируются Тх2 в слизистой кишечника, усиливается синтез sIg A и Ig E. /2295к/ Холерный токсин используется в качестве носителя для доставки различных антигенов (он очень устойчив к действию ферментов слизистых оболочек, а также к лимфоцитам). /2631к/99/ 3. _Полиионы . (полинуклеотиды, полианионы) или смесь тих веществ. /7143/89/ Это неприродные полиэлектролиты с М. от 10 до 100 кД. Полиионы стимулируют иммунный ответ в 30 и более раз. /2380к/ Полиэлектролиты (замещают функцию Тх-ов): комплекс АГ+ полиэлектролит превращает АГ в Т-независимый. Новое поколение вакцин (против чумы и брюшного тифа). /2318к/ - Полиакриловая кислота (ПАК) - Сополимер 4-винилпиридина и 4-винил-N-этилпиридинийбромида (МЕ-3); - сополимер акридиловой кислоты и N-винилпирролидона (NА-5), - полиамин. /2318к/ 4. Использовании _липосом . в качестве адъюванта не получило практического применения. /2295к/ Липосомы - фосфолипидные микроскопические пузырьки.

Липосомы способны адсорбироваться на клетках и их содержимое поступает внутрь клетки.

Липосомы могут захватываться фагоцитами.

Гидрофобные АГ можно вводить в состав фосфолипидов, гидрофильные - как внутреннее содержимое липосом. В экспериментах 'липосомные' вакцины вызывали тысячекратное усиление иммунного ответа. /1430к/ 5. _Другие . соединения. - декстран (стрептококков, вейлонелл ротовой полости) стимулирует гуморальный иммунитет; - метилцеллюлоза - ПАВ (поверхностно-активные вещества) -- бромид диметилдиоктадециламмония (ГЗТ, ингибирует комплемент) -- многоатомные спирты (L101, L121) --- инактивируют комплемент) /2403к/ - тапиока - мурамилдипептиды - sodium alginate /7330/87/ ВАКЦИНЫ - АГ-содержащие препараты микробов или их продуктов (направлены на формирование активного иммунитета) В последней трети ХХ века получила всеобщее признание точка зрения, согласно которой вакцинация является одним из методов борьбы за активное долголетие как в развивающихся, так и в экономически развитых странах.

Целенаправленная вакцинация, проводимая в мире в течение многих лет, обеспечила существенное снижение заболеваемости корью, полиомиелитом, столбняком, коклюшем. /2318к/97/ _Вакцины применяются 1) для профилактики заболеваний -- плановая вакцинация детского населения -- вакцинация определенного контингента в определенных районах /например, вакцины против зооантропонозных инфекций, клещевого энцефалита/), -- вакцинация в определенное время (по эпидемическим показаниям (гриппозная вакцина), При гриппе, как и при любой другой инфекции, можно эффективно воздействовать на эпидемический процесс только после того, как адекватной иммунизацией будет охвачено не менее 80-90% всего населения.

Однако это условие еще никогда не было выполнено. 2) для лечения хронических заболеваний или течений (например, поражениях аденовирусами, вирусом герпеса). /2295к/ Это направление значительно более ограничено. С этой целью используют чаще убитые вакцины (стафилококковую, гонококковую). В России также накоплен большой положительный опыт борьбы с распространенными инфекционными заболеваниями.

Однако в последнее время существенно _снижаются объемы и эффективность вакци- _нопрофилактики ., проводимой в нашей стране. Это обусловлено рядом обстоятельств: - снижается процент лиц, подвергающихся вакцинопрофилактике, что связано с увеличением частоты случаев противопоказаний к вакцинации (ИД, аллергические заболевания), - применяемые в настоящее время вакцинирующие средства относятся к препаратам старого поколения и не обеспечивают стойкий иммунитет у лиц, прошедших вакцинацию. /2318к/97/ - Применение вакцин малоэффективно на фоне ИД-ых состояний. /2318к/97/ - Политико-экономическая ситуация в России.

История Название 'вакцины' было дано Л.Пастером всем прививочным препаратам, полученным из микробов и их продуктов (от лат. vacca - корова). Э.Дженнером была получена первая живая вакцина, содержащая вирус коровьей оспы, идентичный по антигенным свойствам вирусу натуральной оспы человека, но маловирулентный для человека. Это был первый природных вакцинный штамм. Л.Пастер разработал принципы направленного получения вакцинных штаммов - селекцию мутантов с пониженной вирулентностью путем культивирования их в определенных условиях или пассирования через организм устойчивых к данной инфекции животных. /1430к/ Получение вакцин Из стратегий разработки инактивированных вакцин заслуживают внимания следующие. /2631к/99 и др./ 1) Получение микробов методом селекции, пассирования. (Выращивание микробов, очистка.) - Использование целых микробов Вирусные вакцины на - курином эмбрионе - фибробластах - культуре клеток опухоли - культуре клеток почек. - Использование инактивированных микробов (как правило, химическими веществами). /2631к/99/ - Выявление из дивергентных линий возбудителя, возникших в естественных условиях (например, вирус коровьей оспы для прививок против натуральной оспы). (Л Т.А. ) 2) Получение in vitro псевдочастиц, не способных к репликации. /2631к/99/ 3) Создание вакцин на основе секретируемых антигенов, капсульных полисахаридов, полисахаридов, конъюгированных с белками, а также субъединиц микробов и белковых оболочек. /2631к/99/ - Получение рибосомальной фракции микробов --- рибосомальные вакцины. 4) Применение антигенов, синтезированных рекомбинантными микробами и синтезированных антигенов с Ви Т-эпитопами./2631к/ - Генно-инженерные вакцины. - Самосборка VP2-белка парвовируса свиней (псевдочастицы). Данные псевдочастицы используются для доставки в цитоплазму клеток эпитопы, чужеродные цитотоксическим Т-лимфоцитам (ЦТЛ). Это свойство хотят использовать для получения вакцин. /2632к/99/ - 5) Получение ДНК-вакцин. /2631к/99/ 6) Применение в качестве АГ химически и генетически инактивированных токсинов ( _анатоксинов .). /2631к/99/ 7) Использование в качестве антигенов антиидиотипических антител. /2631к/99/ _Общие требования к вакцинам 1. Высокая иммуногенность (либо иммуностимулирующее, либо десенсибилизирующее действие). В идеале иммунитет, создаваемый вакцинами, должен приближаться к иммунитету, формирующемуся после инфекционного процесса, поскольку последний является наиболее напряженным и полноценным. /2299к/90/ 2. Ареактивность (отсутствие выраженных побочных реакций). 3. Безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие. /1430к/ До настоящего времени далеко не все вакцинные препараты отвечают этим требованиям. /1430к/ Введение вакцин (иммунизация) - подкожно (вакцины против кори, АДС-анатоксин), - накожно (оспенная вакцина), - внутрикожно (БЦЖ), - внутримышечно (вакцина АКДС), - перорально (вакцина против полиомиелита). (Л Т.А. ) Мукозальные вакцины - вакцины, вводимые не парентерально, а через рот, аэрозольно, в инстилляциях (впрыскивание в мочевой пузырь, влагалище и пр.) Вакцины (с адъювантом) выпускаются в капсулах или микрокаплях.

Вакцины вызывают синтез sIg A в кишечнике; в кровотоке появляются антитела классов Ig G и Ig A. /2295к/97/ Иммунизация некоторыми препаратами через рот вызывала синтез Ig A и sIg A-антител не только в пейеровых бляшках или стенке кишечника, но и в отдаленных органах - на слизистой бронхов, мочеполового тракта. Т.о., слизистые оболочки действовали как единая система, в пределах которой, по-видимому, происходило распространение активированных лимфоцитов и соответствующих интерлейкинов. /2295к/97/ Индукция синтеза Ig A, характерная для мукозального иммунитета, связана с активацией Тh2 (Т-хелперов второго типа), продукцией ИЛ-4,5,6 и 10. Активность Тх2 связана и с включениемсинтеза Ig E, но введение вакцин через рот обычно не вызывает развития аллергических состояний. /2295к/97/ В слизистых кишечника и бронхов находятся клетки-супрессоры различной природы. В частности, они могут презентировать антигены, но не образовывать медиаторов, необходимых для размножения и дифференцировки лимфоцитов.

Состояние, когда лимфоциты получают лишь 'первый сигнал', но не последующие, может привести к толерантности.

Данный механизм необходим, очевидно, для того, чтобы защитить слизистые от постоянного воспаления, связанного с действием ИЛ-1 и ФНО. Все же такой тип воспаления наблюдается, например, при хроническом рините. /2295к/97/ В связи с возможностью развития иммунологической толерантности в слизистой оболочке кишечника появилось новое направление - оральная десенсибилизация при аллергии, вызванной одним, известным веществом. /2295к/97-14,39/ Возможная индукция толерантности заставляет использовать при создании мукозальных вакцин те или иные адъюванты. /2295к/97/ Варианты мукозальных вакцин 1. рекомбинантным (см. ныше) с бактериальным вектором. 2. липосомные и микрокапсулы (скорость деградации до 2 недель). Использовании липосом в качестве адъюванта не получило практического применения. /2295к/ 3. 'Корпускулярные' вакцины, например, адсорбированных на эритроцитах цыплят живой вирус гриппа (оральное использование). /2295к/ ВИДЫ ВАКЦИН Для профилактики инфекционных заболеваний применяют следующие типы вакцин.

Группа вакцин Примеры по способу Бактерийные вакцины Вирусные вакцины получения и простейших Живые -туберкулезная (БЦЖ=BCG - - коревая, (аттенуированные) Bacille Calmette-Guerin) - паротитная, вакцины -чумная - гриппозная, -сибиреязвенная (СТИ - - полиомиелитная взвесь живых спор) вакцины Сейбина -туляремийная (вакцина - против краснухи Гайского-Эльберта) - антирабическая -бруцеллезная вакцина -холерная - аденовирусная Инактивированные -коклюшная, - гриппозная (или убитые), -брюшнотифозная, - против клещевого корпускулярные -холерная энцефалита -лептоспирозная - полиомиелитная -гонококковая вакцина Солка -бруцеллезная - против краснухи - Лизаты /?/, например, при актиномикозе Химическая -сыпнотифозная - гриппозная (НА (субъединичная) -холерная (холерои NА) ген + О-антиген /ЛПС/) -менингококковая (ПС А и С) -брюшнотифозная Синтетические Полипептиды бактеПолипептиды вирувакцины рий, их токсинов сов, вакцина против (вакцина против вируса гепатита В) дифтерийного токсина, стрептококков) Генноинженерные -АГ стрептококков, АГ нуклеокапсида (рекомбинантные) -липопротеин Pseu- - ВГА (вируса гепа-, вакцины domonas aeruginosa, тита А) -фимбрии кишечной - ВГВ (HBsAg) палочки, - вируса Dengue 4 -ЛПС Vibrio choleraе - белки вируса -О-антигены шигелл бешенства S.sonnei,S.flexneri - Белки вирусов RSV -АГ возбудителей HIV (ВИЧ) столбняка, -АГ туляремийных бактерий, -белки Brucella abortus, -мембранный белок Bordetella pertussis (коклюш), -АГ простейших (Р.berghei, P.yoelii), Антиидиотипические Аналоги анатоксинов вакцины Анатоксины -Противодифтерийная, -противостолбнячная (АДС) -Холероген-анатоксин Ассоциированные вакцины ( поливакцины - ВП) Для одновременной выработки иммунитета против нескольких инфекций с целью сокращения числа прививок в последние годы применяют так называемые ассоциированные вакцины, в состав которых входит несколько моновакцин. (Л Т.А. ) - Примером ассоциированных вакцин, использующихся в настоящее время, в настоящее время для иммунизации детей являются широко применяемая во всем мире АКДС-вакцина, а также паратитно-коревая и краснушно-паротитно-коревая вакцины, применяемые в ряде зарубежных стран. (Л Т.А. ) - Например, ВП-4 (вакцина без адъюванта, разработанная Институтом вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова, Москва) содержит растворимые АГ St.aureus, Kl.pneumoniae, Proteus vulgaris, E.coli. Используется для лечения хронических инфекционных заболеваний дыхательной системы (в т.ч. микробно-обусловленной астмы). /2295к/ - Бронхомунал (ВП) /используется перорально/. /2295к/ - Вакцина бронховакс содержит антигены Diplococcus oneumoniae, Haemoph. influenzae, Neisseria catarralis, St.aureus, Str.pyogenes, Str.viridans. /2295к/ Аутовакцины , полученные из микробной культуры больного (например, при хронических стафилококковых инфекциях, гонорее и др.) {Быстро эволюционирующие микробы - вирусы гепатитов, ВИЧ, гриппа; меняющие АГ + гонококки, боррелии.] ДНК-вакцины (плазмидные) стимулируют клеточный иммунитет (но не гуморальный). При введении некоторых ДНК-вакцин в организм не экспрессировался закодированный в ДНК белок и не синтезировались АТ. Одновременно с этим имела место индукция весьма выраженного клеточного иммунитета. /2579к/99/ Классификация вакцин по способам получения _ Живые (аттенуированные = ослабленные) вакцины 1) Жизнеспособные микробы, несущие 'свои' АГ 2) - ' - , несущие АГ другого вида микроба ('химеры'), созданные генноинженерным путем (векторы). - см. ниже Живые аттенуированные препараты вызывают вакцинальный процесс, идентичных инфекционному, иногда с некоторыми клиническими проявлениями. (Л Т.А. ) В соответствии с требованиями ВОЗ _живая вакцина . должна быть - непатогенной (специфически безопасной) для человека, - стабильной, - защищать от пенетрации и размножения в клетках кишечника, - создавать защиту от заражения вирулентным штаммом, - нести один или более маркеров для идентификации вакцинного штамма среди диких культур в организме хозяина и окружающей среде. /1365к/ _Достоинства живых вакцин - Создают напряженный иммунитет, сходный с инфекционным. - Достаточно однократной вакцинации, так как вакцинный штамм может размножаться и персистировать в организме. - Для иммунизации необходимы гораздо меньшие количества живой вакцины. /1633к/ _Недостатки живых вакцин - Антирабическая вакцина иногда вызывает энцефалит (мозговые АГ). - Применение живых вакцин опасно для людей (особенно детей) с врожденными или приобретенными ИД=ми состояниями, на фоне которых возбудители с пониженной вирулентностью могут вызвать тяжелую генерализованную инфекцию (например, паралитический полиомиелит при агаммаглобулинемии). - Сохраняется вероятность обратной мутации и приобретения вирулентных свойств.

Противопоказание к применению - первичное иммунодефицитное состояние, иммуносупрессия, злокачественные новообразования, беременность.

Убитые вакцины готовят из микроорганизмов, обладающих максимально выраженной иммуногенностью, инактивированных прогреванием, УФ-лучами, химическими веществами (формалином, фенолом, спиртом и др.) в условиях, включающих денатурацию АГ-ов. /1430к/ _Недостатки - Меньшая иммуногенность - Необходимость повторного введения - Использование адъювантов - Аттенуированных или убитый возбудитель - это множество различных антигенных детерминант, из которых 'протективностью', т.е. способностью индуцировать защитный иммунитет, обладают очень немногие.

Необходима очистка от токсичных, индифферентных и аллергизирующих компонентов. _ Цельновирусные вакцины Цельновирусные вакцины содержат помимо нужных НА и NА также липиды, повинные в пирогенных, токсических и реактогенных эффектах при проведении прививок.

Наличие липидов не позволяет увеличивать дозировку антигенов, т.к. немедленно ухудшается переносимость прививки.

Субъединичные вакцины Состоят из фракций цельных убитых микробов (ЛПС, токсинов и др.). _Достоинства - наименее реактогенны - моновалентны - Аллерговакцины - конъюгат аллергена и полиэлектролита (полиоксидония) снижает аллергенную активность, что способствует индукции 'блокирующих' Ig G-антител. /2327к/97/ _Недостатки - наименее иммуногенны; используются с адъювантами - необходимость дробного введения. /1430к/ Более иммуногенными следует считать вакцины субъединчиные из белков микроорганизмов, полученных с помощью генной инженерии и синтетические пептидные вакцины. (Л Т.А. ) - Рибосомальные вакцины Рибосомальная вакцина - рибосомальная фракция микробов, включающая антигены.

Препарат рибомунил (мукозальная вакцина) включает рибосомальную фракцию из культур Klebsiella pneumoniae, Diplococcus pneumoniae, Str. pyogenes, Haemophilus influenzae. /2295к/ Рибосомальная вакцина - микробная вакцина; у одних микробов (шигелл) основную иммуностимулирующую (антигенную) роль играют белковые компоненты, у других микробов - РНК. 30 лет назад открыли иммуностимулирующие свойства рибосомальной вакцины - рибосомы выступают в качестве адъювантов. Это естественная комплексная (случайный комплекс с другими мембранными структурами, на которых есть АГ) вакцина.

Генноинженерные (рекомбинантные) вакцины созданы на основе картирования геномов микробов. Гены, контролирующие нужные антигенные детерминанты, переносят в геном других микробов и клонируют в них, добиваясь экспрессии генов в новых условиях. /1430к/ Рекомбинантные вакцины - микроносители + белковый антиген + адъювант (холерный токсин и пр.). В качестве векторов в живых рекомбинантных вакцинах используются малопатогенные сальмонеллы, аденовирусы, полиовирусы, вирус Vaccinia. Такие вакцины вызывали развитие как местного, так и системного иммунитета, характеристика которого зависела от использованного вектора (Табл.). /2295к/ - Например, вирус Vaccinia c протективным белком G вируса бешенства размножается в кишечнике и вызывает местный и системный иммунный ответ; аденовирус c протективным белком G вируса бешенства лучше размножается в легких (аэрозольное введение). /2295к/ - Малопатогенную Salmonella typhimurium используют в качестве бактериального вектора как носителя поверхностного белка лейшманий (gp63), а также белка С тетанотоксина. /2295к/ Рекомбинантные оральные вакцины /2295к/ Векторы Антигены S.typhi Поверхностный белок Str.mutans S.dublin Липопротеин Pseudomonas aeruginosa Фимбрии кишечной палочки ЛПС Vibrio cholerae S.typhi О-антигены шигелл (S.sonnei, S.flexneri) S.typhimurium Антигены возбудителей столбняка, туляремии, белки Brucella abortus, Str.major, M-белок Str.pyogenes, мембранный белок Bordetella pertussis, простейших (Р.berghei, P.yoelii), вирусов нуклеокапсида - ВГА, - ВГВ, - вируса woodcbuek hepaitis, поверхностный антиген вируса Dengue 4. Adenovirus Белки вируса бешенства Vaccinia virus Белки вируса бешенства, RSV, HIV, HBsAg Polio virus Белки вируса HIV Е.с.

Химические (синтетические) вакцины представляют собой искусственно синтезированные короткие пептиды, имитирующие небольшие структуры оболочки вирусов, бактериальных структур (т.е. они моделируют природные аналоги, но в отличие от них не содержат 'баластного материала', который не существенен для создания иммунитета, а лишь загрязняет материал. (Л Т.А. ) Можно использовать комплекс выделенных в чистом виде антигенных детерминант (эпитопов), конъюгировать с носителем (полиэлектролитом, белком и ввести подобную искусственную вакцину в организм. /1430к/ Антиидиотипические вакцины - вакцины на основе антиидиотипических антител, которые являются 'внутренним образом' АГ и тем самым могут вводиться в организм вместо АГ патогенных микробов.

Показано, что антитела против антитоксического Ig могут иммунизировать подобно анатоксину. (Л Т.А. ) Виды побочного действия вакцин Недостатки Вакцинация - одно из крупнейших достижений биологии.

Однако техника вакцинации до сих пор несовершенна. Самое гласное - невозможно гарантировать абсолютную безопасность вакцины. 1. _ Фармакологическое действие вакцин Вакцины могут влиять на работу сердца, легких, почек, эндокринной, нервной систем и пр. ЛПС коклюшного ЛПС может вызвать лихорадку, судорожный синдром, энцефалопатию. /2259к/95/ Вакцины вызывают образование различных медиаторов.

Например, ИФ вызывает лихорадку, гранулоцитопению и токсические явления в ЦНС, ИЛ-1 является одним из факторов воспаления. /2259к/95/ 2. _ Поствакцинальный инфекционный процесс, вызванный - _ остаточной вирулентностью вакционного штамма; Например, лимфадениты и остеомиелиты после введения БЦЖ. Вакцино-ассоциированный полиомиелит, корь. /2259к/95/ - _ реверсией патогенных свойств вакцинного штамма 3. _ Туморогенное действие Используемые для биотехнологии (получения рекомбинантных вакцин, препаратов) материалы могут быть контаминированы различными вирусами и микоплазмами. Для контроля препаратов применяются современные методы молекулярного анализа (определение содержания ДНК, аминокислотной и нуклеоидной последовательности, методы молекулярной гибридизации с применение цепной полимеразной реакции и др.). /2259к/95/ Присутствие в препаратах гетерологичной ДНК в большой концентрации представляет онкогенную опасность, так как ДНК может вызывать инактивацию супрессорных онкогенов или активацию протоонкогенов после ее интеграции с клеточным геномом. По требованиям ВОЗ, содержание гетерологичной ДНК в 1 дозе вакцины не должно превышать 100 пг, а для препаратов ИФ и МАТ, вводимых людям многократно, оно устанавливается в каждой стране национальным контрольным органом. /2259к/95/ 4. _ Индукция образования антител к непротективным антигенам _ вакцин Число антигенных детерминант в одной вакцине может достигать нескольких десятков. Лишь небольшая часть этих детерминант обеспечивает развитие антиинфекционного иммунитета.

Остальные антигены вызывают продукцию АТ-свидетелей, не играющих существенной роли в становлении иммунитета. Такую бесполезную работу ИС выполняет при введении многокомпонентных вакцин, рассчитанных преимущественно на создание клеточного иммунитета. /2259к/95/ 5. _ иммуномодулирующее действие вакцин . : - _ действие антигенов вакцин Многие возбудители (БЦЖ. коринебактерии parvum, B.pertussis, Nocardia, L.monocytogenes) и бактерийные препараты (пептидогликаны, ЛПС, белок А и др.) обладают ярко выраженным неспецифическим иммуномодулирующими свойствами, влияющими на развитие ИО к другим АГ. Например, В.pertussis влияет к опустошению тимус-зависимых зон лимфоидной ткани. Этот возбудитель усиливает активность макрофагов, Т-хелперов и Т-эффекторов и подавляет активность Т-супрессоров. /2259к/95/ - _ действие сорбента, носителей и др.; - _ действие цитокинов, присутствующих в вакцинах Многие цитокины, например, ИЛ-1, ИЛ-6, гранулоцитарный и гранулоцитарно-макрофагальный КСФ (ГМ-КСФ), могут присутствовать в полиомиелитной, антирабической, коревой, паротитной, краснушной вакцинах. Такие цитокины, как ИЛ-1, ФНО, могут присутствовать в МАТ. /2259к/95/ 6. _ Индукция аутоиммунных состояний а) При наличии перекрестных АГ у микробов (с АГ человека) Например, перекрестные АГ между полисахаридом менингококковой В-вакцины и гликопротеином клеточных мембран млекопитающих. /2259к/95/ б) При наличии перекрестных АГ примесей и АГ человека.

Примеры для сравнения: - вирус (вакцина), выращенный на культуре клеток почек человека и хомяка, - вирус (вакцина), выращенный на культуре клеток фибробластов, - вирус (вакцина), выращенный на культуре опухолевых клеток - др. 7. _ Аллергия . : - _ к антигенам вакцин Столбнячный анатоксин способен вызывать атопию (одни компоненты - атопию, другие - ГЗТ). - _ к примесям и добавкам Большинство вакцин содержат различные примеси и добавки: гетерологичный белок, консерванты, ростковые факторы, стабилизаторы, сорбенты и др. Они могут быть причиной побочных реакций, прежде всего аллергических осложнений. /2259к/95/ Значительную опасность представлет примесь чужеродного белка (яичный альбумин, БСА и др.) в вакцине. Такой белок входит в состав большинства вирусных вакцин. По требованию ВОЗ, гриппозная вакцина должна содержать овальбумина не более 5 мкг/доза, /2259к/95/ Пример для сравнения: вирус, выращенный на курином и гусином эмбрионе.

Кильковый бульон (МПБ). Ранее в некоторые вакцины добавляли стрептомицин, который вызывал тяжелые аллергические реакции вплоть до анафилактического шока. В настоящее время используются антибиотики со слабыми аллергенными свойствами. /2259к/95/ В качестве инактиваторов и консервантов вакцин применяют фенол, формальдегид и мертиолят.

Побочные реакции на мертиолят возникают редко. /2259к/95/ - _ к экзоаллергенам, не связанным с вакциной Вирус гриппа А усиливает выделение гистамина на аллерген у больных аллергией. /2259к/95/ 8. _ Индукция иммунодефицитных состояний Микробные АГ способны активировать клетки-супрессоры, вызывать выделение супрессорных факторов из этих клеток, секрецию Pg E 2 из макрофагов и т.п. /2259к/95/ 9. _ Психогенное действие вакцин Ярко выраженные психоэмоциональные свойства прививаемого могут усиливать местные и общие реакции вплоть до обморока при инъекции вакцины. /2259к/95/ Календарь прививок Для достижения желаемого иммунитета при проведении активной иммунизации большое значение имеют реакции инокулирования антигена, т.е. наличие определенных интервалов между его введением.

Соблюдение этого правила важно с 2 точек зрения: - организм человека, находящийся в процессе иммуногенеза в результате введения прививочного антигена, в течение определенного времени не способен ответить на новое наслаиваемое антигенное раздражение развитием иммунитета (отрицательная фаза иммунитета) (Л Т.А. ); - вакцинация организма, находящегося еще в начальной фазе иммунологической перестройки, под влиянием предшествующей вакцинации может вызывать повышенные реакции и осложнения.(Л Т.А. ) Активная иммунизация не обуславливает у всех прививаемых детей одинаковую степень невосприимчивости.

Существуют группы детей, которые не способны к выработке антител.

Поэтому очень важным является использование для иммунизации оптимального момента для ребенка в целях получения высокого иммуностимулирующего эффекта. (Л Т.А. ) Поскольку активная иммунизация вызывает выработку иммунитета лишь после определенного периода ... В соответствии с принятым календарем профилактических прививок вакцинация детского населения проводится в 2 направлениях: - массовая вакцинация и - вакцинация отдельных групп (по специальным показаниям). (Л Т.А. ) К первой относятся профилактические прививки против туберкулеза, полиомиелита, коклюша, дифтерии, столбняка, кори, паротита, гриппа; ко второй - против брюшного тифа, холеры, туляремии, бруцеллеза, сибирской язвы, лептоспироза, чумы, лихорадки Ку, клещевого энцефалита. (Л Т.А. ) Утверждено приказом N 375 от 18.12.1997г.

Календарь профилактических прививок детям и подросткам Вид вакциСроки Сроки ревакцинации Примечание нации вакцинации 1 2 3 4 Вакцина 1 сут. 1-ый 5-6 - Первая схема против (новомесяц месяц гепатита В рожденным) - ' - 4-5 5-6 12-13 - Вторая схема месяц месяц месяц Против 4-7 6-7 14-15 Вакцинацию и ревактуберкуледней лет лет цинацию проводят за (БЦЖ (1 (8-9 однократно. (противоили БЦЖ-М) класс) класс) показания - вес ребенка менее 2000 кг, келлоидных рубец после предыдущей дозы) Против 3 мес. 18 мес 2 года 6 лет 11 Вакцинация может прококлюша, 4 мес. (через мес. (АДСлет водиться одновременно дифтерии и 5 мес. 12-18 (ОПВ) М, (АД с вакцинацией против столбняка мес. ОПВ) -М) полиомиелита. (АКДС),ОПВ после 16, Далее - 16-17 лет -оральная закон- 26, (АДС-М), взрослые полиомиеченной 36, (АДС-М или АД-М) литная вакци- 46, однократно каждые 10 вакцина нации) лет лет.

Противопоказание - прогрессирующие заболевания нервной системы, афебрильные судороги в анамнезе (вместо АКДС вводят АДС) Вакцина 12-15 6 лет Противопоказания: против месяцев тяжелые реакции на кори, аминогликозиды, паротита и анафилактические краснухи реакции на яичный белок.

Примечания: - Ревакцинация вакциной БЦЖ проводится неинфицированным туберкулезом детям. - Вакцинация против кори, эпидемического паротита и краснухи проводится моновакцинами или тривакцинами (корь, краснуха, эпидемический паротит) - Для проведения последующих прививок минимальный интервал - 4 недели. _Противопоказания .: - Сильная реакция или осложнение на предыдущую дозу (наличие температуры выше 40 о С, отек, гиперемия больше 8 см в диаметре в месте введения вакцины, реакция анафилактического шока). - Первичное иммунодефицитное состояние, иммуносупрессия, злокачественные новообразования, беременность (для всех живых вакцин). Календарь прививок в эндемичных, зоотипичных районах и по эпидемическим показаниям Вид вакциСроки Сроки Примечание нации вакцинации ревакцинации Против С 2 лет чумы Против С 7 лет Через каждые туляремии 5 лет Против С 18 лет Через 1 год бруцеллеза /?/ Против ? Через 1 год Только профессиональным сибирской контингентам язвы Против С 7 лет лептоспироза Против С 14 лет лихорадки Ку Против С 4 лет Ежегодно на клещевого протяжении энцефалита 3 лет Против С 7 лет Через 2 года брюшного тифа Против С 3 лет Лицам, относящимся к гриппа группе повышенного риска Против С 9 месяцев Лицам, выезжающим в желтой зарубежные страны, лихорадки эндемичные по этой инфекции ИММУНОКОРРЕКТОРЫ Иммунопрофилактика (иммуностимуляция) - профилактика у иммунокомпрометированных индивидов (например, до сезонного подъема заболеваемости) с использованием витаминов, микроэлементов, адаптогенов и препаратов, нормализующих обменные процессы. /1652к/ Иммунокоррекция (иммунореабилитация) - это в известной мере иммуностимуляция или иммуносупрессия у людей без видимого проявления патологии и у больных, с возможностью регулирования этих процессов или при помощи дозировки препаратов или и комбинаций. /1652к/ 35% больных нуждаются в иммунокоррекции.

Правильная оценка состояния иммуной системы необходима для грамотной иммуномодуляции и иммунопрофилактики больных.

Иммунокорректоры: метилурацил, пентоксил, левамизол, аскорутин, препараты кальция в возрастных дозировках. /1629к/ Иммунотерапия - терапевтические мероприятия у лиц с определеннной патологией с использованием препаратов крови, аутовакцин, различных аллергенов, аллергоидов и др. /1652к/ Иммуномодуляция - термин, отражающий работы по исследованию препаратов с разнонаправленным эффектом в зависимости от доз и схем. /1652к/ Проблема в отсутствии строго селективных иммуномодуляторов (повсеместно используют препараты общего действия), практически полном отсутствии для клинического использования иммуномодуляторов селективного действия на отдельные звенья иммунной системы, на конкретные популяции и субпопуляции лимфоидных клеток. А в отношении влияния на специфические клоны лимфоцитов практически нет даже научных разработок. /2157к/97/ Т.о., в современных клинических условиях речь может идти лишь о 'грубом' выявлении иммунологических нарушений и о назначении больным более или менее профильных иммунокорригирующих препаратов общего действия. /2157к/97/ _По происхождению . (действия на разные звенья ИС): 1. Биологические (растительные экстракты; препараты, выделенные из организма человека, крупного рогатого скота /крс/, морских животных; препараты из крови и их других биологических жидкостей), - иммуноглобулины (крови, молока женщин и сельскохозяйственных животных: чагоин, лактоглобулин и др.) 2. Микробные (выделенные из микроорганизмов: вакцины и пр.), - колибактерин, бифидумбактерин, - пирогенал, продигиозан, сальмозан, - биоцил, иском, кукумариозид и др. 3. Синтетические (синтезированные искусственно). /1652к/... _По природе . ('избирательность' действия препаратов): 1) полисахариды 2) вакцины (BCG, ССВ, MRV, полиомиелитная вакцина ...), 3) препараты НК, синтетические полинуклеотиды, 4) производные имидазола, 5) ИФ, тимозин, 6) гормональные средства 7) витамины 8) средства нейромедиаторного действия. /1652к/ Ни один препарат не оказывает избирательного действия на клетки, участвующие в иммунном ответе. /1652к/ Иммуномодулирующие свойства присущи и биогенным аминам.

Большие гранулярные лимфоциты способны депонировать и высвобождать биогенные амины.

Макрофаги могут способствовать депонированию гистамина и серотонина в лимфоцитах из окружающей среды. /1674к/ _По механизму действия: 1. препараты, действующие на клеточную кооперацию (преимущественно на Тили В-систему): Т-активин, миелопид, левамизол, диуцифон и др. 2. препараты, действующие на иммуно-нейроэндокринную регуляцию (медиаторы, нейропептиды, гормоны, цитокины): лейцин-энкефалин, субстанция Р, нейротензин и др. 3. препараты экстра (транс) иммунного типа действия (адаптогены, витамины, микроэлементы, коферменты, препараты, влияющие на восполнение пластических и энергетических ресурсов): - элеутерококк, женьшень, экстракт левзеи (адаптогены) - рибоксин, оротат калия, линетол, штарк-протеин, политабс, изопринозин, - ундевит, декамевит, токоферол, кобаламид и др. 4. препараты с неизвестным механизмом действия: - димиколат, проксанол 268, бонафтон, АДА 202-718 и др. /1652к/ Можно выделить группу 'ретропрепаратов', имеющих длительную историю использования в практике без учета их иммуномодулирующих свойств (аспирин, теофиллин, кофеин, фенамин и др.). /1652к/ . ОЦЕНКА ИММУННОГО СТАТУСА ОРГАНИЗМА До исследования собственных компонентов иммунной системы следует оценить фагоцитарную и комплементарную активность. АГ Фагоцитоз (АПК) HLA II HLA I+II Тх/Тs ИО Тх/Тs АТ Тк Гуморальный Клеточный иммунитет иммунитет ИК клетка-мишень (КМ) Активация комплемента (ИК-С1q, ИК-С3в) Лизис Фагоцитоз Фагоцитоз через Фагоцитоз через FcR комплементарные мертвой рецепторы клетки __________________________________________________________/ _При фагоцитарной недостаточности . преципитаты ИК-ов, деструктированные клетки активируют свертывающую систему и при истощении (общем или локальном) антикоагулянтов развивается тромбофилия ( _склонность к тромбозам .) Т.о. основной фактор, определяющий элиминацию из организма чужеродных и собственных неполноценных субстанций - фагоцитоз (полноценный завершенный эндоцитоз). Поэтому оценку иммунного статуса следует начинать с лейкоцитарной формулы, общего количества лейкоцитов, _оценки фагоцитарной активности . (степени завершенности по НТС-тесту) и как отражение гуморального иммунитета (степень растворения ПИК и утилизации из кровотока ИК) - активность _системы комплемента .. Стимулировать иммунную систему (использовать иммуностимуляторы) при недостаточности по системе комплемента нельзя, так как лишние ИК (при избытке АТ) не будут элиминироваться из кровотока. [Физиологический механизм данной регуляции - фрагменты С3 регулируют созревание В-лимфоцитов, т.е. при недостатке С3 синтез АТ 'прекращается', так как утилизации ИК не будет.] ОЦЕНКА ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА - Определение абсолютного (камера Горяева) и относительного (мазок) числа нейтрофилов и моноцитов. - Определение фагоцитарной активности; -- оценка функциональной активности макрофагов (хемотаксиса, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутриклеточной инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна), - Определение общей гемолитической активности комплемента.

Количественное определение компонентов комплемента С3, С6-С8, субкомпонента С1q. - Количественное определение ЕКК,определение активности ЕКК. - Тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА или цитокины активированных определенным антигеном лимфоцитов. ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов или чужеродных частиц.

Снижение числа нейтрофилов ниже 25% от нормы опасно для жизни. /2269к/ после комплементарного лизиса АПК, КПК АТ Фагоцитоз после 'работы' антител (ИК) уровень АТ комплексов с фибронектином, альфа-2-макроглобулином, С-РБ, лектинами и пр. Для изучения поглощения используют бактериальные клетки (St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интенсивно фагоциты поглощают чистицы, обработанные сывороткой, содержащей опсонины (Ig G, комплемента, фибронектин, СРБ и др.). /2291к/ При определении фагоцитарной активности определяют следующие показатели: - фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофилов к общему количеству нейтрофилов; - фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел, захваченных каждой клеткой; - опсонический индекс - переваривающая способность - постепенное уменьшение ( в течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных микробов вплоть до их полного обесцвечивания; - завершенность фагоцитоза - отношение лейкоцитов с завершенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированными микробами, выраженное в процентах. /272-53/ _ Методики . : Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro и в условиях in vivo. I. In vitro. - Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК; - Радиометрические методы изучения стадии захвата. - Тест восстановления нитросинего тетразолия. По реакции восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гексозомонофосфатного шунта. /1583-4/ II. In vivo. Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызываютлокальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мл 2млрд-ой культуры Staphylococcus albus. Через 10-15 минут из перитонеальной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифугирования), окрашивают метиленовым синим.

Незавершенный фагоцитоз (наблюдается при поглощении туберкулезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, менингококков, вирусов, риккетсий) : Рис. 'Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)' Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отношение умерщвленных и всех поглощенных микробов (примерно равно 0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ): - высокая ЗФ (1,0-0,82); - средняя (0,81-0,45); - слабая (0,44-0,32); - очень слабая (0,31-0,29) - ЗФ отсутствует (0,28-0,25) Фагоцитарная активность (фагоцитоз стафилококка) Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильева и соавт. (1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического планшета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х 10 9 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные лунки вводили по 10 мкл расстворов изучаемых полипептидов, в контрольные - 10 мкл фосфатного буфера.

Лейкоцитарно-микробную взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в течение 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкубации взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 минут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах.

Поглотительную способность фагоцитов оценивали по следующим показателям: 1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших клеток из числа сосчитанных нейтрофилов; 2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом. Для оценки переваривающей функции нейтрофилов определяли показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле: общее количество переваренных микробов ПЗФ = -------------------------------------- х 100 %. общее количество поглощенных микробов Чувствительным методом оценки функциональной активности фагоцитов является метод определения хемилюминесценции крови. /7062/ - Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2% цитрата натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микрококков); - для определения опсонического индекса в опытную пробу дополнительно добавляетя антисыворотка к микробам или сыворотка больного для определения функциональной активности антител к микробам; - выдержать в термостате 30 мин. при 37 0 С. - приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси; - высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон: краситель Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный препарат наносят 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (одновременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют водопроводную воду, 5 капель на 5 минут.

Промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсией. - В мазке определяют а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейкоцитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают 100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%. б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное количество микроорганизмов, например, 567 во всех фагоцитирующих гранулоцитах /80/ и делят на число фагоцитов.

Частное от деления (567:80=7) отражает сруднюю поглотительную способность одного фагоцита. в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого либо рассчитывают частное от деления ФЧ (фагоцитарного числа) больного на ФЧ здорового донора (при этом ОФИ должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпирическим методом, с помощью которого анализируют состояние 25 нейтрофилов по следующей схеме: Количество микроОценка фагоцитоза Количество нейтОФИ бов, фагоцитиророфилов с данной ванный одним степенью фагоцигранулоцитом тарной активности 0 0 2 0х2=0 от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5 от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20 от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24 Итого: ОФИ=49 Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ равен 10. ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+); от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++); от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++). Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%. Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?. Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (иммунной сывороткой) или комплементом - Опсонический индекс - больше 1. Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие антител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации комплемента в крови исследуемого фагоцитоз резко ускоряется, т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

Оценка степени перекисного и радикального окисления по НСТ-тесту (NBT-тест) Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с образованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ является индикатором респираторного взрыва (показывает готовность нейтрофилов к завершенности фагоцитоза). Низкая реактивность нейтрофилов в динамике заболевания может служить неблагоприятным прогностическим признаком. /2737к/87/ Сущность метода заключается в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при восстановлении НСТ супероксидным радикалом. Метод высокоинформативен - для оценки функциональной активности фагоцитов, - прогнозирования тяжести заоблевания, - контроля за эффективностью антибактериального лечения, - дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных заболеваний и пр. /2291к/ - Получены доказательства высокого уровня корреляции между образованием активных форм кислорода и киллингом. Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы веществ в количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоровых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина 250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетразолия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали при температуре 37 о С в течение 30 минут, встряхивая планшеты каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, готовили мазки и высушивали на воздухе.

Готовые мазки фиксировали метанолом 10 минут, высушивали и докрашивали 0,5% раствором сафранина. В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать опсонизированный зимозан или активатор протеинкиназы С - форболмиристат ацетат. /2291к/ Об интенсивности радикалообразования судят по количеству диформазана, который откладывается в виде грубодисперсных темносиних гранул внутри или на поверхности активированного нейтрофила. /7062/ При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100 нейтрофилов, среди которых определяли процент клеток, содержащих отложения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы). Далее расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле: А х 0 + Б х 1 + В х 2 + Г х 3 ИАН = ----------------------------------- , 100 где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложений; Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра; В - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины ядра; Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по площади превосходит площадь ядра. НСТ-тест может быть сделан без дополнительной стимуляции (спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro (индуцированный НСТ-тест). /7062/ При патологии чаще ПОЛ растет.

Поэтому если лечение выбрано правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает, опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/ Сниженные показатели НСТ-теста --- неблагоприятный исход (сепсиса) Повышенные показатели НСТ-теста --- опасность развития гнойных осложнений после операции.

Нормальные показатели НСТ-теста --- успешная терапия. /1365к/ [Преципитат с НСТ может образовывать гепарин. /1575к/90/] На стекла с прилипшими клетками капают 5 капель (0,14 мл) 1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл). (Pack B.I. и соавт. // Lancet. - 1968. - V.2. - P.532): 0,2% раствор НСТ (0,1 мл на 0,1 мл взвеси лейкоцитов, выделенных из гепаринизированной крови). Пробирку со смесью помещали в термостат (37 о С) на 25 минут, затем выдерживали при комнатной температуре 15 минут, после чего готовили мазки, фиксировали в метаноле и окрашивали гематоксилином. В мазках подсчитывали % гранулоцитов, включающих красители.

Лизосомально-катионный тест (ЛКТ) Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лунки иммунологического планшета, в которые вносили по 20 мкл цельной крови здоровых доноров, взятой со скарифицированной ранки пальца руки при помощи пипетки, предварительно промытой раствором гепарина 250 ед/мл.

Полученную взвесь клеток крови инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готовили мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окрашивали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуференном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в течение 20 минут.

Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным раствором азура А. Окрашенные препараты промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и микроскопировали с использованием масляной иммерсии. При исследовании просматривали 100 гранулоцитов.

Внутриклеточное содержание катионных белков крови оценивали полуколичественно по величине среднего цитохимического коэффициента (СЦК), вычисляемого по формуле: 3а + 2б + 1,5в + 1г + 0,5д + 0а СЦК = -----------------------------------------, 100 где: а-е - количество однотипных клеток с определенной степенью окрашиваемости цитоплазмы зеленым прочным, а цифры показывают степень выраженности окраски; 0 - отсутствие окраски; 0,5 - наличие в цитоплазме единичных окрашенных гранул; 1 - половина цитоплазмы заполнена светлоокрашенными гранулами; 1,5 - цитоплазма равномерно заполнена гранулами, окрашенными в светло-зеленый цвет; 2 - цитоплазма содержит 1/3 часть своей площади темнозеленых гранул; 3 - цитоплазма содержит 2/3 части своей площади темнозеленых гранул.

Определение хемотаксической активности лейкоцитов Недостаточный хемотаксис сдерживает мобилизацию фагоцитов, способствуя опережающему размножению бактерий.

Снижение миграционной активности нейтрофилов в 2 раза сопровождается затяжным торпидным течением пневмонии более чем у 50% детей. /7062/ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕЙ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА _Изотонический вероналовый буфер (VBS) .. 1 л раствора содержит 5,095 г веронала и 41,5 г NaCl, рН доводится до 7,40 1 М раствором NaOH. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз. _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Са 2+ и Mg 2+ _(VBS 2+ ) .. 2 л раствора содержит 5,75 г веронала, 3,0 г мединала, 85,0 г NaCl, 5 мл 1 М MgCl 2 и 1,5 мл 1 М СаСl 2 , рН доводится до 7,40. Перед работой буфер разбавляют в 5 раз. _Изотонический вероналовый буфер, содержащий ионы Mg 2+ и ЭГТА _(VBS, . _Mg 2+ -ЭГТА) .. К 850 мл изотонического вероналового буфера (VBS), разбавленного в 5 раз, добавляется 100 мл 0,1 М раствора ЭГТА, рН 7,4 и 50 мл 0,1 М раствора MgCl 2 , рН доводится до 7,40. _Изотонический фосфатный буфер (РВS) 0,85% раствор NaCl, содержащий 2% по объему 0,2 М натрий-фосфатного буфера, рН 7,20. _Изотонический трис-буфер с ЭДТА (TBSE) .. Содержит 5 мМ трис, 0,15 М NaCl, 10 мМ ЭДТА . Na 2 , рН 7,2 (доводится 0,01 М NaOH). _Раствор Олсвера .. В 750 мл дистиллированной воды растворяли 8,0 г цитрата натрия (дигидрата натриевой соли), 4,2 г NaCl и 20,0 г глюкозы, добавляли ~ 5,5 мл 10% лимонной кислоты до рН 6,1 и доводили объем раствора до 1 л. Для взятия крови раствор Олсвера стерилизовали.

Другие буферные растворы готовили по общеизвестным методикам. _Приготовление стандартных взвесей эритроцитов Эритроциты барана. Кровь барана из яремной вены отбирали с соблюдением асептических условий в равный объем стерильного раствора Олсвера со стеклянными шариками, перемешивали и стерильно разливали по пробиркам.

Оставляли на 3-7 суток при 4 о С для стабилизации клеток.

Стерильно отобранные эритроциты можно хранить около 2 месяцев при 4 о С. _Приготовление стандартной взвеси бараньих эритроцитов .. Осадок эритроцитов трижды промывали 10-20-кратным объемом VBS 2+ с последующим центрифугированием (1000 g) в течение 5-10 мин.

Отмытые эритроциты суспендировали в VBS 2+ таким образом, чтобы после 15-кратного разбавления водой суспензия обладала поглощением при 541 нм равным 0,7, что соответствует концентрации клеток в суспензии 1 . 10 9 клеток/мл. Для стандартизации пользовались формулой V k = V o . A 541 /0,7, где V k - конечный объем суспензии, V o - начальный объем с концентрацией, определяемой по величине А 541 . Стандартизированные эритроциты хранили при 4 о С и использовали в работе в течение нескольких суток. _Приготовление сенсибилизированных эритроцитов (ЕА) .. К взвеси эритроцитов (стандартизированных до 1х10 9 клеток/мл) прибавляли равный объем гемолитической сыворотки, разбавленной VBS 2+ в отношении 1:400, тщательно перемешивали и инкубировали 30 мин при 37 о С, периодически перемешивая. После завершения инкубации взвесь эритроцитов доводили до концентрации 1,5 . 10 8 клеток/мл, добавляя VBS 2+ таким образом, чтобы 0,2 мл суспензии ЕА в смеси с 2,8 мл Н 2 О давали 1,0 ед. оптической плотности при 412 нм.

Стандартизированную взвесь ЕА хранили при 4 о С и использовали в работе в течение одного дня.

Эритроциты кролика получали, отбирая кровь из ушной вены животного в стерильный раствор Олсвера, который постоянно перемешивали со стеклянными бусами.

Эритроциты хранили в этом растворе при 4 о до 1,5-2 месяцев. Для стандартизации эритроциты отмывали трижды раствором VBS с последующим центрифугированием при 1000-1500g в течение 5 мин, дважды - раствором VBS, Mg 2+ -ЭГТА и в последнем буфере приготовляли стандартную суспензию таким образом, чтобы при 15-кратном разбавлении дистиллированной водой (0,2 мл суспензии и 2,8 мл Н 2 О) она имела поглощение 1,0 при 412 нм.

Стандартную взвесь эритроцитов кролика использовали в работе в течение одного дня.

Эритроциты барана и кролика более стабильны (менее подвержены спонтанному лизису), если буферы, используемые для стандартизации, содержат 0,1% человеческого сывороточного альбумина. _Инактивация комплемента .. Для проведения серологических реакций систему комплемнта часто инактивируют при 56 о 30 минут. При этом теряют активность С2,С4,фактор В, в результате чего прерывается активация как КПК, так и АПК. Определение общей гемолитической активности системы комплемента Предложено несколько методов определения уровня комплемента. _Классический путь активации системы комплемента . (КПК) определяли по методу P.G.Adrian (1983) и S.Tanaka et al. (1986). Для постановки реакции использовали суспензию эритроцитов барана в концентрации 109 клеток/мл, предварительно сенсибилизированных антисывороткой к ним. К 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 0,75 мМ CaCl2, добавляли 20 мкл рабочей концентрации сыворотки здоровых доноров, разбавленной в том же буфере.

Рабочая концентрация сыворотки подбиралась таким образом, чтобы лизировалось 50-60 % эритроцитов за 20 минут. В систему вносили 20 мкл раствора исследуемого полипептида (контроль- 20 мкл веронал-мединалового буфера). Пробы инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре, после чего вносили 200 мкл суспензии эритроцитов барана, сенсибилизированных антителами. Смесь встряхивали и инкубировали 20 минут при температуре 37С в водяной бане. По истечении времени реакцию гемолиза останавливали погружением пробирок в ледяную баню и разведением системы охлажденным забуференным физиологическим раствором (2,5 мл буфера). Эритроциты осаждали при 3000 об/мин в течение 5 минут.

Степень лизиса эритроцитов определяли спектрофотометрически по оптической плотности супернатанта при длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку. Для определения _альтернативного пути активации . системы комплемента /АПК/ (Козлов Л.В., Соляков Л.С., 1982; Tanaka S. et al., 1986) к 280 мкл веронал-мединалового буфера (рН 7,4), содержащего 5 мМ MgCl2 и 10 мМ этиленгликоль-тетрауксусной кислоты добавляли рабочую дозу сыворотки здоровых доноров (20 мкл) и 20 мкл исследуемого полипептида. Смесь инкубировали при комнатной температуре 20 минут, а затем добавляли 200 мкл суспензии эритроцитов кролика в буфере (1,5х10 8 _ .клеток/мл). Смесь встряхивали и помещали в водяную баню при температуре 37С на 20 минут.

Реакцию гемолиза останавливали добавлением 2,5 мл охлажденного до 4С забуференного физиологического раствора, а затем содержимое пробирок центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 минут.

Степень лизиса эритроцитов определяли на спектрофотометре при длине волны 412 нм против пробы, не содержащей сыворотку.

Гемолитический метод титрования комплемента по 50% или 100%-му гемолизу Титром комплемента является наменьшее количество исследуемой активности сыворотки, способствующее полному гемолизу добавленного количества (0,5-1 мл) сенсибилизированных эритроцитов. Для титрования комплемента по 100%-му гемолизу активную исследуемую сыворотку, разведенную в 10 раз, разливают в 11 пробирок в количестве 0,1; 0,2; 0,3; 0,4 ... 1; 1,1 мл.

Сыворотку доводили физиологическим раствором до 1,5 мл, после чего в каждую пробирку добавляют 1 мл гемолитической системы (1,5% взвесь эритроцитов барана, обработанных антителами в конечном титре 1:3). Учет результатов производили после 45-минутного инкубирования взвеси в термостате при 37 0 С. Для расчета берут пробирку, в которой получен полный гемолиз.

Например, полный гемолиз произошел в пробирке N 4 с дозой активной сыворотки 0,4мл; следовательно, титр комплемента равен 0,04. СН 50 - минимальное количество сыворотки, которое вызывает лизис 50% сенсибилизированных бараньих эритроцитов, находящихся в 0,5мл стандартной суспензии при 37 0 С в течение 30 минут.

Количественное определение уровня комплемента в весовых единицах Среди больных с бактериальными инфекциями (пневмония, сепсис) опсонический резерв альтернативного пути активации комплемента нередко в 5-10 раз ниже нормы. /7062/ Классический путь более устойчив к нарушениям внутренней среды и менее пригоден для их регистрации. /7062/ При падении активности АПК до 30% от среднего уровня взрослых септические проявления пиогенного процесса отмечали у 80% больных. /7062/ Приготовление реагентов для определения активности отдельных компонентов комплемента _Сыворотка человека. . Донорскую кровь отбирали в сухую стерильную посуду и оставляли на 2 суток при 4 о С. После этого сыворотку крови сливали декантацией и центрифугировали в течение 20 мин при 3000g. Супернатант разливали по пробиркам и хранили при -70 о С. _Приготовление реагента R2 для определения гемолитической ак- _тивности компонента С2 .. Сыворотку разливали в тонкостенные пробирки по 3 мл и инкубировали в водяном термостате при 50 о С (внутри пробирок). Отбирали пробы через каждые 10 мин, определяя активность компонентов С1, С1q, С4 и контроль на гемолиз по методике определения С2, используя в качестве R2 отобранную пробу. В качестве R2 выбирали сыворотку, инкубированную в течение такого времени, при котором сохраняется активность компонентов С1 и С4 при достаточно низком контроле. R2 хранили при -70 о С в течение года. _Приготовление реагента R4 для определения гемолитической ак- _тивности компонента С4 .. К 1 мл комплемента морской свинки добавляли 0,25 мл 0,075 М раствора гидразингидрата, смесь инкубировали 1,5 ч при 20 о и нейтрализовали добавлением 0,25 мл 0,15 М HCl, после чего диализовали против РВS в течение 18 ч при 4 о С. Реагент хранили при -70 о С и использовали в качестве R4 после предварительного разбавления VBS 2+ в соотношении 1:3. _Приготовление реагента R3 для определения гемолитической ак- _тивности компонента С3 .. К 10 мл охлажденной до 4 о С свежей сыворотки при непрерывном перемешивании медленно приливали 10 мл охлажденного насыщенного при 4 о С раствора КВr. Смесь инкубировали 18 ч при 4 о С, затем диализовали в течение 18 ч против PBS. Реагент хранили при -70 о С. В качестве R3 использовали реагент, разбавленный VBS 2+ в соотношении 2:3. _Приготовление реагента R3 . oxy _ для определения гемолитической _активности компонента .. Реагент R3 oxy готовили окислением компонента С2 в реагенте R3. Реагент R3 готовили как описано выше.

Окисляющий раствор готовили растворением 8,3 г KI и 0,25 г I 2 в 4 мл фосфатного буфера, рН 6, ионная сила 0,1 (105 мл 1 М NaH 2 PO 4 + 35 мл 0,5 M Na 2 HPO 4 + H 2 O до 1,5 л), затем доводили объём до 10 мл тем же буфером.

Хранили в темной склянке при 4 о в течение недели.

Окисляющий раствор (10 мкл) добавляли к 2 мл реагента R3 инкубировали 5 мин при 4 о и нейтрализовали избыток иода добавлением 1 мг глюкозы на 1 мл пробы.

Реагент R3 oxy хранили при -70 о и использовали в качестве реагента R3 oxy после предварительного разбавления VBS 2+ в соотношении 1:3. _Приготовление реагента R1q с помощью IgG-стекла .. К 10 мл сыворотки крови человека добавляли 37,2 мг ЭДТА . Na 2 , осторожно перемешивали на магнитной мешалке до растворения соли (конечная концентрация 10 мМ) и доводили 0,15 М NаОН до рН 7,2. Подготовленную таким образом сыворотку наносили на колонку с IgG-стеклом (9,5х2 см), уравновешенную TBSE, со скоростью 15 мл/ч.

Колонку промывали 50 мл TBSE со скоростью 35 мл/ч.

Фракции несвязавшегося на колонке белка (50 мл) не проявляли активности С1q. Фракции несвязавшегося белка с максимальным поглощением при 280 нм объединяли (18 мл), добавляли раствор, содержащий 0,3 М CaCl 2 , 1 M MgCl 2 , pH 7,4, из расчета 15 мкл раствора на 1 мл фракции, доводили до рН 7,4, диализовали в течение ночи против VBS 2+ , разливали небольшими аликвотами по пробиркам, замораживали и хранили при -70 о С. Использовали в качестве реагента R1q, после размораживания непосредственно перед титрованием С1q. _Получение реагента R1 с помощью IgG-стекла. 5 мл охлажденной сыворотки при 4 о наносили на колонку с IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную VBS pH 7,4, содержащим 0,001 М СаСl 2 , со скоростью 8 мл/ч.

Фракции несвязавшегося белка собирали по 2 мл и определяли остаточную активность С1q и С1r 2 s 2 , фракции с максимальным поглощением при 280 нм объединяли (10мл), диализовали против VBS 2+ в течение ночи, разливали небольшими аликвотами по пробиркам, замораживали и хранили при -70 о . Колонку IgG-стекло-С1 использовали в дальнейшем для выделения С1q, C1r и C1s. Гемолитические методы определения активности компонентов и факторов комплемента _Определение гемолитической активности компонентов С2 и С4 .. К 0,2 мл стандартизованной суспензии ЕА в VBS 2+ добавляли 0,05 мл реагента (R4 или R2 в соответствующем разведении) и 0,25 мл тестируемой пробы. Смесь инкубировали 30 мин при 37 о , добавляли 2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугировали при 1500g в течение 5 мин.

Степень гемолиза определяли по А 412 , измеренному против буфера. Кроме того, ставили контроли на спонтанный лизис (0,2 мл ЕА и 0,3 мл буфера), а также контроль на полный лизис эритроцитов (0,2 мл ЕА и 2,8 мл Н 2 О). Измеренную величину гемолиза выражали в виде Z (количество эффективных молекул), которую определяли по формуле: Z = ln _К П.Л. _ К R К П.Л. - А 412 , где К R - контроль реагента (буфер вместо тестируемой пробы), К П.Л. - контроль на полный лизис эритроцитов, А 412 - измеренное значение тестируемой пробы. _Определение гемолитической активности компонентов С3 .. К 0,2 мл ЕАС14 (приготовление комплекса описано ниже) добавляли 0,05 мл реагента (R3 или R5 в соответствующем разведении), 0,25 мл тестируемой пробы и смесь инкубировали при 37 о в течение 30 мин. После инкубации добавляли по 2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугировали при 5 мин при 1500g. Степень гемолиза определяли по поглощению при 412 нм, измеренному против буфера. В качестве контролей ставили контроль реагента (0,25 мл буфера вместо тестируемой пробы), контроль на спонтанный лизис эритроцитов (0,2 мл ЕАС1 4 и 0,3 буфера) и контроль на полный лизис эритроцитов (0,2 мл ЕАС1 4 и 2,8 мл Н 2 О). Измеренные значения гемолиза выражали в виде Z аналогично определению активности компонентов С2 и С4. _Приготовление комплекса ЕАС14 .. 10 мл ЕА (концентрация 1 х 10 9 клеток/мл) инкубировали с 1,0 мл R2 при 37 о в течение 10 мин.

Комплекс промывали VBS 2+ до полного исчезновения фона (лизированные эритроциты) с последующим центрифугированием при 1500g в течение 5 мин.

Отмытый комплекс стандартизировали до концентрации 1,5 х 10 8 клеток/мл как описано для ЕА. Комплекс ЕАС14 использовали в работе в течение одного дня. _Приготовление комплекса ЕАС1q с ограниченным числом эффек- _тивных молекул С1q. . К 200 мкл суспензии ЕА (1,5 х 10 8 клеток/мл) добавляли подобранное количество раствора С1q в общем объеме 300 мкл.

Инкубировали 30 мин при 37 о С. Реакцию останавливали охлаждением и добавлением 700 мкл охлажденного VBS 2+ . Комплекс промывали 1 раз VBS 2+ /HSA и количество гемолитических эффективных молекул С1q определяли с помощью реагента R1q. _Получение комплекса ЕАС14 с ограниченным числом эффективных _молекул С4b. . К 10 мл суспензии ЕА (1,5 х 10 8 клеток/мл) добавляли 100 мкл реагента R2 и инкубировали 5 мин при 37 о . Реакцию останавливали охлаждением до 0 о в ледяной бане.

Комплекс промывали 3 раза VBS/HSA с центрифугированием и стандартизовали по А 412 при гемолизе.

Количество гемолитических эффективных молекул С4b определяли с помощью реагента R4. _Приготовление стабилизированной мембраносвязанной С3-конвер- _тазы ЕАС142 oxy . . К 6 мл суспензии ЕАС14 (1,5 х 10 8 клеток/мл) добавляли при 0 о 180 мкл реагента R3 oxy , 30 мкл 0,1 М NiCl 2 и инкубировали 5 мин при 37 о , реакцию останавливали охлаждением до 0 о в ледяной бане.

Добавляли 4 мл VBS, содержащего ЭДТА (VBSE) и центрифугировали 5 мин при 1500g. Полученный комплекс ЕАС142 oxy промывали 3 раза VBS 2+ и стандартизовали при А 412 , как описано выше. _Определение гемолитической активности С3-конвертазы. . К 0,2 мл суспензии ЕАС142 oxy (1,5 х 10 8 клеток/мл) добавляли 0,1 мл сыворотки, разведенной 1:9 VBS, содержащего 0,05 М ЭДТА (VBSE). Общий объём доводили до 0,5 мл VBSE и инкубировали 30 мин при 37 о . Реакцию останавливали добавлением 2,5 мл 0,15 М NaCl и центрифугировали 5 мин при 1500 g. Степень гемолиза определяли в супернатанте при А 412 . _Выделение функционально активных субкомпонентов С1, первого _компонента комплемента, на аффинном сорбенте. . 20 мл сыворотки крови человека наносили на колонку с IgG-стеклом (9,5 х 2 см), уравновешенную 0,01 М трис-HCl-буфером с 0,15 М NaCl и 0,001 М СаСl 2 , рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 0 о . После полного нанесения сыворотки протекание раствора через колонку останавливали и колонку инкубировали с сывороткой 40 мин при 0 о для полного связывания комплекса С1. Колонку промывали стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая белковые фракции (А 280 ) и определяя в них остаточную активность С1q и С1r 2 s 2 . _Получение С1r 2 . . Колонку с IgG-стеклом с сорбированным С1 нагревали при 30 о в течение 40 мин для активации С1. Затем проводили элюирование при 0 о стартовым буфером со скоростью 20 мл/ч, собирая фракции по 3 мл. В белковых фракциях определяли активность С1r и С1s. _Получение С1s. . После элюирования С1r стартовым буфером проводили элюирование С1s 0,05 М ЭДТА трис-НСl-буфере, содержащем 0,15 М NaCl, рН 7,4, со скоростью 20 мл/ч при 0 о . Фракции, обладающие активностью С1s (около 60 мл) объединяли и концентрировали ультрафильтрацией до 5,5 мл. С1s хранили при 4 о с 0,01% NaN 3 в течение года. _Получение С1q. . После элюирования С1s субкомпонент С1q элюировали с колонки с IgG-стеклом 0,02 М трис-НСl-буфером, содержащим 1,0 М NaCl, 0,03 ЭДТА, рН 8,5 со скоростью 20 мл/ч при 0 о . Фракции, содержащие активность С1q, объединяли и белок осаждали сульфатом аммония при 33% насыщения. Для дальнейшей очистки осадок С1q растворяли и фракционировали на колонке с сефакрилом S-300, как описано в работе [48]. ОЦЕНКА ДРУГИХ ФАКТОРОВ НЕСПЕЦИФИЧЕКОЙ ЗАЩИТЫ Определение ферментативной активности мурамидазы (лизоцима) Записать метод определения лизоцима (ферментативной активности мурамидазы). В опытную пробирку наливают 0,4мл 0,15М солевого фосфатного буфера с рН 6,2, добавляют 0,1 мл исследуемой сыворотки крови. К полученной смеси приливают 2 мл стандартизированной (Е=0,66 на ФЭК в кювете N 5 при светофильтре N 6) бактериальной взвеси суточной культуры микрококка в фосфатном буфере. Пробы помещают в термостат на 30 минут при температуре 37 0 С, затем замеряют оптическую плотность на ФЭК в кювете N 2 с зеленым светофильтром.

Мониторинг за концентрацией фибронектина Слежение за уровнем фибронектина в плазме позволяет прогнозировать направленность патологического процесса. При снижении концентрации фибронектина до 100 мкг/мл (при норме 300 мкг/мл) практически у всех детей развивались тяжелые токсические синдромы. Для возмещения фибронектина в терапии токсических заболеваний можно использовать криопреципитат (10-15 мл на инфузию). Даже однократная введение оказывает положительный эффект у 65% больных. /7062/ Определение содержания серомукоида (Mejbaum-Kkatzenellenbogen W.,1955) К 0,2 мл сыворотки крови добавляют 0,2 мл 0,95% водного раствора NaCl и 0,9 мл 0,45М сульфосалициловой кислоты. В течение 30 минут смесь центрифугируют при 1500 об./мин. К 0,3 мл надосадочной жидкости дабваляют 0,6 мл физраствора и 4 мл 0,1% водного раствора танина, перемешвают и помещают на 30 минут в кипящую водяную баню.

Содержимое пробирки охлаждают и измеряют оптическую плотность в кювете с длиной оптического пути 10 мм на ФЭК при длине волны 590 нм против дистиллированной воды.

Содержание серомукоида в биологических жидкостях выражают в единицах оптической плотности полученного раствора. В норме в сыворотке крови содержание серомукоида составляет 0,11-0,13 единиц оптической плотности.

Реакция кольцепреципитации определения С-РБ Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же конеч треть - исследуемой сывороткой.

Капилляр покачивают 12-15 раз для смешивания ингредиантов и устанавливают вертикально на пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной температуре.

Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности деструктивных процессов в организме). Результат оценивают по высоте приципитата в капилляре.

Определение концентрации фибриногена Гравиметрический метод. К 1 мл плазмы крови добавляют 0,05 мл суспензии тромбопластина (10 мг/мл) для быстрого и полного образования сгустка, 0,1 мл 5% раствора хлорида кальция, перемешивают. Через 7-15 минут инкубации при 37 о С образовавшийся сгусток отжимали до полного удаления сыворотки и взвешивали на торсионных весах.

Полученную величину умножали на коэффициент 0,222. Концентрацию выражали в г/л. ш1. 1999г. ЗАПОЛНЯТЬ ТОЛЬКО В ЛЕКЦИИ ПО НЕСПЕЦ. ФАКТОРАМ Содержание БОФ В норме При остром воспалении СРБ (усл. ед.) 70 нг/мл,т.е. 0,1 г/л почти нет - у новорожденных 100 нг/мл с постепенным возрастанием Фибриноген 2-4 г/л 3-4 г/л 6-10 г/л Гаптоглобин (Нр) 170-300мг/л (70-150 мг%); 830-2700мг/л 0,1-0,04г% 0,6-1,8 г/л 3-6 г/л Преальбумин 300 + 20 мкг/мл Орозомукоид (Оm) 550-1400 мг/л = мкг/мл 0,6-0,9 г/л 1,5-3 г/л Антитромбин-III 210-300 мг/л С3-компонент 550-1200 мг/л комплемента 1,3-1,7 г/л 2-3 г/л /2809к/ 100 мг% С1q-субкомпонент 100% комплемента Трансферрин 3030 + 350 мкг/мл Церулоплазмин 260 + 30 мкг/мл 0,3-0,6 г/л 1-2 г/л альфа-2-макроглобулин 2150 + 150 мкг/мл (500-2500 мг/л) альфа-1-антитрипсин 2200 + 200 мкг/мл альфа-1-антипротеаз- 2,5-4,0 г/л 5-7 г/л ный ингибитор /???/ -? Оценка ПОЛ Определение активности каталазы . Активность каталазы определяли в гемолизатах крови на основе способности перекиси водорода образовывать окрашенных комплекс с молибдатом аммония.

Инкубационная смесь объемом 2 мл содержала 0,03% Н 2 О 2 . Реакцию инициировали внесением 0,1 мл гемолизата в разведении 1:1000. Продолжительность инкубации - 10 минут.

Температура 25 градусов. По окончании инкубации приливали 1 мл 4% молибдата аммония и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Для расчета активности фермента использовали коэффициент мольной экстинции цветного комплекса Н 2 О 2 и молибдата аммония - 10 2 М -1 см -1 . Активность каталазы выражали в ммолях Н 2 О 2 с -1 л -1 . Определение содержани МДА . МДА определяли в цельной крови по цветной реакции с ТБК (Бородин Е.А.,Арчаков А.И.,1987). К 1 мл образца добавляли 1 мл 30% ТХУ и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 10 минут. К надосадку приливали 1 мл 0,8% ТБК и ставили на кипящую водяную баню на 15 минут. По окончанию инкубации пробирки охлаждали, приливали 1 мл хлороформа и центрифугировали при 3000 об./мин. в течение 5 минут для удаления мутости.

Верхнюю окраенную фазу осторожно переносили в кювету и измеряли светопоглощение при 532 нм. При расчете содержания МДА в пробе использовали коэффициент мольной экстинции 1,56х10 -5 М -1 см -1 . Содержание МДА выражали в наномолях на 1 мл крови.

Определение диеновых конъюгатов . 0,1 мл спиртового раствора липидов вноили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой находились 2,9 мл абсолютного спирта.

Оптическую плотность измеряли при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм. Для перерасчета использовали коэффициетн мольной экстинции 2,2х10 -5 М -1 см -1 (Стальная И.Д.,1977). Величину диеновых конъюгатов выражали в наномолях на 1 мл крови.

Определение гидроперекисей липидов . Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe 2+ c последующей реакцией на Fe 3+ с тиоцианатом аммония (Романова Л.А., Стальная И.Д.,1977 в модификации Е.А.Бородина). Для расчета содержания гидроперекисей использовали коэффициент мольной экстинции образующегося цветного комплекса Fe[Fe(CNS)] 6 при 490 нм 1,1х10 5 М -1 см -1 , а в расчете на ион Fe 3+ 0,55х10 5 М -1 см -1 (Бородин Е.А. и соавт.,1992). Величину гидроперекисей выражали в наномолях на мл крови.

Определение окисляемости сыворотки крови . Окисляемость сыворотки крови изучали по степени накопления МДА при индукции Fe 2+ аскорбат-зависимого или НАДФН-зависимого ПОЛ в инкубационной смеси объемом 1 мл, содержащей 12 мкМ Fe 2+ ; 0,8 мМ аскорбат (или 1 мМ НАДФН); 0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НСl буфер, рН 7,4; 0,1 мл сыворотки крови и выражали в наномолях МДА мин -1 мл -1 сыворотки крови.

Определение антиокислительной (антиоксидантной) активности (АОА) крови . АОА сыворотки крови оценивали в условиях in vitro по их способности тормозить аскорбат (НАДФН)-зависимое ПОЛ в суспензии микросом (М.А.Штарберг,1996) и выражали в процентах.

Опытная инкубационная смесь объемом 1 мл содержала 0,8 мМ аскорбат (или 1 мМ НАДФН); 0,2 мМ пирофосфат натрия; 50 мМ трис-НCl буфер, рН 7,4; 0,5 мг фосфолипида микросом, 0,1 мл сыворотки крови. ПОЛ инициировали внесением ионов Fe 2+ в конечной концентрации 12 мкМ. Контрольная проба аналогичного состава не содержала сыворотки крови. АОА рассчитывали по формуле: МДА контроль - МДА опыт АОА = х 100%. МДА контроль Определение токсигенной зернистости нейтрофилов . Токсигенную зернистость изучали с иммерсионной системой микроскопа в препаратах крови, окрашенных по Паппенгейму, Нохту. В сравнении с нейтрофильной зернистостью нормальных лейкоцитов она более крупная и интенсивнее окрашивается. Учет ведут суъектвино по количеству гранул, их размерам и интенсивности окраски: (-) или (+) (Ронин В.С., Старобинец Г.М.,1989). Парамецийный тест . Сущность методы оценки токсичности биологических жидкостей с парамецийным тестом (Пафомова Г.А. и соавт. /1980/ с добавлением условий по Нифантьеву О.Е. и соавт. /1988/) заключается в измерении времени жизнеспособности парамеций (инфузорий) - 'парамецийного времени' в присутствии токсического фактора, находящегося в биологической жидкости. В качестве контроля определяли время выживаемости инфузорий в присутствии плазмы или сыворотки крови здоровых людей. 0,01 мл исследуемой биологической жидкости и столько же взвеси, содержащей от 8 до 10 парамеций, тщательно перемешивали и под увеличением объектива в 25 раз определяли время полной гибели парамеций.

Образец исследовали 3 раза и использовали средние данные. С целью повышения точности способа использовали 11-15-суточную культуру парамеций. _Проверка дефицита Se в организме .: кончики пальцев рук протереть спиртом, затем 7,5% Н 2 О 2 . Если кожа побелеет, то дефицит. /со слов проф. М.А.Джулай/ Определение бактерицидной активности сыворотки (БАС) (= комплемент, + лизоцим, + катионные белки) В пробирки с 2,5 мл стерильного бульона Кольбака добавляют по 0,5мл испытуемой сыворотки. Затем микропипеткой во все пробирки вносятпо 0,1 мл 24-часовой бульонной культуры кишечной палочки.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и отбирают 1,5 мл для нефелометрического измерения оптической плотности. Смесь, оставшуюся в пробирках, помещают в термостат при 37 0 С на 3 часа. (Расчет бактерицидной активности в процентах производится по ниже описанной формуле.) Таким образом, удается снять 2 показателя: первый - характеризующий исходную оптическую плотность бульона с культурой и сывороткой сразу после смешения, и второй - регистрирующий оптическую плотность той же смеси после 3-часовой инкубации смеси в термостате. (Д опыта через 3 часа - Д опыта сразу) х 100 = (Д контроля через 3 часа - Д контроля сразу) (0,18 -0,163) х 100 = = 7,8% 0,312 - 0,095 Биологический метод - парамецийный тест Сущность метода заключается в измерении времени жизнеспособности парамеций (инфузорий) -'парамецийного времени' в присутствии токсического фактора, находящегося в биологической жидкости. В качестве контроля определяют время выживаемости инфузорий в присутствии плазмы или сыворотки крови здоровых людей. 0,01 мл исследуемой биологической жидкости и столько же взвеси, содержащей от 8 до 10 парамеций, тщательно перемешивают и под увеличением объектива в 25 раз определяют время полной гибели парамеций.Образец исследуют 3 раза и расчитывают средние данные. С целью повышения точности способа используют 11-15 суточную культуру парамеций. время жизнеспособности парамеций при добавлении к их культуре биологической жидкости здоровых людей составляет 25-30 минут (106,137,47-ЛИИ - лейкоцитарный индекс интоксикации) Определение содержания МСМ в сыворотке крови, лимфе (молекулы средней массы) Принцип метода основан на осаждении белков исследуемой жидкости 10% р-ром ТХУ с последующим центрифугированием при 3000 об/мин в течении20 мин. и определением поглощения супернатанта, в 10 раз разведенного дистиллированной водой, (при длине волны 280 нм) против воды.

Сдержание МСМ выражают в условных единицах, соответствующих величине оптической плотности разведенного супернатанта. В норме количество МСМ составляет 0,260,280 условных единиц (24, 102) Определение общей протеолитической активности В кювету спектрофотометра вносили 0,03 мл цельной сыворотки крови, 1,97 мл 0,05М трис НС1 буфера и 1,0 мл 1,5*10 -3 М БАЭЭ в этом буфере, перемешивали.

Оптическую плотность измеряли в течении 30 мин. через каждые 10 мин при длине волны 253 нм против раствора не содержащего сыворотку крови.

Протеолитическую активность выражали в МЕ/мл. (100) Оценка активности катепсина D Определение количества кислоторастворимых продуктов ферментного гидрролиза гемоглобина (6). Инкубационная смесь содержала 0,5 мл сыворотки крови, 0,5 мл 0,2М ацетатного буфера и 0,2 мл 0,3% раствора гемоглобина в ацетатном буфере.

Продолжительность инкубации60 мин. t=45 0 С. По окончании инкубации приливали 4 мл 3% ТХУ (трихлоруксусная кислота), замеряли при длине волны 280нм.

Содержание катепсина Д выражается в условных единицах.

Определение содержания альфа-1-АТ и альфа-2-МГ Способ определения альфа-1-АТ и альфа-2-МГ в плазме (сыворотке) крови основан на различном механизме взаимодействия их с трипсином при использовании в качестве субстрата БАЭЭ (N-бензоил-L-аргинин этиловый спирт)1. Альфа-1-АТ образует с трипсином комплекс, неспособный гидролизовать комплекс БАЭЭ. Поэтому его активность оценивается по торможению БАЭЭ-эстеразной активности трипсина сывороткой крови. В кюветах спектрофотометра готовили контрольную и опытную пробы.

Опытная проба содержала 1,9 мл 0,005 М трис НС1 буфера (рн 8,0), 0,1 мл разведенной в 50 раз сыворотки крови и 0,1 мл 0,1% раствора трипсина.

Контрольная проба содержала 2 мл 0,05 М трис НС1 буфера (рн8,0) и 0,1мл 0,1% раствора трипсина.

Инкубировали при t=25 0 5 мин и добавлялти по 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ. Быстро перемешивали и измеряли прирост оптической плотности растворов при длине волны 253 нм против контроля.Отсчеты производили каждую минуту в течении 5 мин. При расчете активности фермента использовали разность средних значений прироста активности за 1 мин.

Активность альфа-1-АТ выражается в ИЕ/мл. Альфа-2-МГ образует с трипсином комплекс, сохраняющий способность к гидролизу БАЭЭ с сывороткой крови и последующей инактивацией несвязавшегося с альфа-2-МГ трипсина соевым ингибитором трипсина (86). В кювету спектрофотометра вносили 1,75мл 0,05М трис НС1 буфера, рн 8,0, 0,1 мл разведенной в 10 раз сыворотки крови и 0,05МЛ 0,1% раствора трипсина .Инкубировали 5 мин при t=25 0 С, добавляли0,1 мл 0,3% раствора ингибитора из бобов сои, перемешивали и инкубировали 5 мин. Затем добавляли 1 мл 1,5 мМ раствора БАЭЭ, пробу перемешивали и измеряли прирост оптической плотности при длине волны 253 нм через 2 мин в течении 10 мин против контрольной пробы, содержащей только реактивы (2мл 0,05М трис НС1 буфера, рн8,0 и 1 мл 1,5мМ раствора БАЭЭ) расчета активности фермента использовали среднее значение прироста оптической плотности за 1 мин.

Активность альфа-2-МГ выражали в ИЕ/мл сыворотки крови.

Оценка фагоцитарной активности (+ см. материал 1-2 лекции) Фагоцитарный индекс - среднее количество частиц или микробов в одном фагоците (норма 3-8). Фагоцитарное ч исло - количество фагоцитов, участвующих в фагоцитозе (норма 60-80%). Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 минут фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 и 60 минут, в связи в перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется. /2551к/ _Переваривание микробов . можно оценивать путем посева лизатов лейкоцитов на питательные среды и подсчета выросших колоний. Метод предполагает использование в качестве объекта фагоцитоза живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами фагоциты осаждают центрифугированием, омывают и лизируют. Их лизаты высевают на твердую питательную среду.

Переваривающую активность фагоцитов оценивают по числу выросших колоний. /2551к/ _Метаболическую активность фагоцитов . определяют после окраски их 0,25% раствором нитросинего тетразолия. В норме метахроматично (диффузно и в виде глыбок голубого цвета) окрашивается 15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40% и более. /2551к/ Показатели фагоцитоза снижаются при иммунодефицитах, повышаются при благоприятном течении инфекции. /2551к/ Оценка комплементарной активности 1) Общая гемолитическая активность комплемента должна быть 100 _+ .20% от уровня здоровых доноров.

Степень гемолиза можно определить фотометрически (с помощью нефелометра, спектрофотометра, фотоколориметра) или визуально путем сравнения интенсивности гемолиза в опытных пробирках со стандартной шкалой лизированных эритроцитов. /2551к/ 2) Уровень отдельных компонентов можно оценить по реагентам (R) по степени компенсации отсутствующего в них белка при добавлении сыворотки больных. (R1 - cыворотка с дефицитом компонента С1, R2 - сыворотка с дефицитом компонента С2, R3 - - ' - С3, R4 - - ' - С4 и т.д.) _В сыворотке крови С1q - 190 мг/л, С1s - 120 С2 - 30 С4 - 430 С3 -1300 С5 - 75 С6 - 60 С7 - 55 С8 - 60 С9 - 160 ф. Р - 25 ф. В - 240 С1-In - 180 мг/л. /2551к/ 3) Выявление отдельных продуктов активации - С5а (по степени агрегации лейкоцитов), С4а, С3а, С3в, С2в-кинина и др. 4) Определение комплемент-связывающих рецепторов на лейкоцитах (CR1, CR2, CR3). /2551к/ ОБЩАЯ ИММУНОГРАММА Специфическая защита Гуморальная Клеточная - АТ - Тк Различают следующие степени иммунитета: 1. полная восприимчивость инфекции (100% гибель); 2. Слабый иммунитет; 3. умеренный иммунитет; 4. сильный иммунитет (летальных случаев нет); 5. полный иммунитет (абсолютная резистентность)./261/66/ Широкая вариабельность показателей иммунитета, изменчивость в течение года не всегда позволяет полно оценить картину системы иммунитета. /1677к/ Вторичный ИО на экзогенные АГ не отражает состояния иммунной системы. Для оценки иммунного статуса необходима информация о первичных гуморальных или клеточных реакциях на антиген. /7576/84/ НОРМАЛЬНАЯ ИММУНОГРАММА Общее количество лейкоцитов - 4-9 тыс./мкл Подсчет в камере Горяева (25 больших квадратов) N х 4000 х 20 (разведение) N х 1000 L = = = N х 200 25 х 16 5 N должно быть от 20 (4 тыс.) до 40 (8 тыс.). Лейкоцитарная формула: Размер Нейтрофилов - 50-60% 10-12 мк Эозинофилов - 3-5 12-17 мк Базофилов - 0,5-1 10-12 мк Моноцитов - 5-8 12-15 мк (тканевые - больше) Лимфоцитов - 25-35% 7-8 мк малые; около 12 мк - большие (тканевые лимфоциты - еще больше) Эритроциты - 7 _+ .0,5 мк Тромбоциты - 2(-4) мк [ ПОЛ на стекле --- лимфоцитоз ] Лимфоцитов от 25% (т.е. от 1000 до 2250 мкл-1) до 35% (т.е. от 1200 до 3000 мкл-1). Подсчет абсолютного количества лимфоцитов у больного: Например, общее количество лейкоцитов - 5 тыс/мкл, количество лимфоцитов в лейкоцитарной формуле - 20% (=относительное количество лимфоцитов); Абсолютное количество - 20% от 5 тыс, т.е. 1 тысяча в 1 мкл. Вывод: меньше нормы.

Количество лимфоцитов - 1800-3200 мкл -1 , (800-3600 в мкл); - 25-35% (20-26% /2551к/) всех лейкоцитов. _В крови В-лимфоцитов - 15% . /2338к/94/ (15-25%); CD19+, CD22+, CD72 + -клетки - 10-15% (В-клетки); (CD72+ -клетки - 30-35%) - ??? _Т-лимфоцитов - 60% ., из них Тх - 20% (CD4 + -клетки-36-42%) Тs - 12% (CD8 + -клетки-28-35% = Тs + Тк) CD3 + -клетки - 55-70% (общие Т-лимфоциты) _О-лимфоцитов - 25% . /2338к/94/, (10%) _Т-лимфоциты .: - CD 3 - 600-2500 (1000-1400) мкл -1 (в среднем 1400); - в тесте розеткообразующих клеток (Е-РОК) Т общие (=То) - 50-60 (50-70%, 40-90)% от общего количества лимфоцитов; - CD2+, CD3+ - 70-85% /2551к/98/ - Та-лимфоциты (Т активные =Та) - 700-1100 мкл -1 или 25-35%; Для выявления активированных Т-лимфоцитов определяют рецептор к ИЛ-2 (CD25), HLA DR-антигены и CD 71 (рецептор для трансферрина). _Тх-лимфоциты . (CD4+) - 700-1100 мкл -1 (930); - Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%. - CD4+ - 35-48% /2551к/98/ При снижении Тх до 200 - СПИД прогрессирует; _Тs-лимфоциты . (CD 8+) - 300-500 мкл -1 (500); - CD8+ - 18-25% /2551к/98/ = Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20% Соотношение Тх/Тs (= CD4+/CD8+) - 2,0-2,5 (1,5-2,5$ 1,4-2,0); - При СПИДе соотношение уменьшается до 0,04. - При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2,0. /2551к/98/ _В-лимфоциты . (CD 19,CD22, CD72)- 350-500 (100-900;600-800) мкл -1 или 15-25 (10-30)% /?/ (в тесте В-РОК=ЕАС-РОК) _Иммуноглобулины сыворотки крови - Ig M - 1-2 (0,35-3; 0,2-2) г/л или мг/мл - Ig G - 11-15 (8-13, до 20 - у пожилых лиц) г/л или мг/мл - Ig A - 1-3 (0,4-4,4; 1,4-3) г/л или мг/мл У новорожденных уровень Ig G близок к материнскому, Ig M и Ig A имеются в следовых концентрациях. К 4-6 месяцу уровень Ig G падает до 5-6 г/л, а затем увеличивается. При нормальном развитии уровень иммуноглобулинов к 2 годам у детей близок величинам их у взрослых. /2551к/98/ - Разброс значений Ig E (0-386 кЕ/л) не позволяет рекомендовать этот тест для диагностики атопии. /1676к/ При иммунодефицитах (ИД) уровень Ig снижается, а при стимуляции ИС и воспалении - повышается. /2551к/ Иммуноглобулины сыворотки крови Классы МЕ/мл мг/мл мг% г/л В слюне Ig G 130-160 11-15 800-1800 (1200) 12,8 + 0,54 0,06 + 0,01 - Ig G1 2,61-10,8 г/л - Ig G2 1,12-4,08 - Ig G3 0,22-2,88 - Ig G4 0,05-1,56 Ig M 110-150 0,5-2,0 60-200 (120) 1,3 + 0,1 0 г/л Ig A 90-150 1-3 90-450 (400) 1,6 + 0,7 0,03-0,4 г/л = sIg A Ig E 0,006-0,6( 75,9 + 9,3 КИ/л Ig D 30,9 + 4,0 0,3-40 (3) МЕ/л-? Иммуноглобулины слюны /1652к и др./ Классы МЕ/мл мг/мл мг% г/л КИ/л Ig G 0,06 + 0,01 Ig M 0 Ig A 0,07 + 0,01 sIg A 0,72 + 0,05 Определение уровня иммуноглобулинов не всегда полезно. Для иммунной защиты имеет значение количество специфических антител, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки.

Антитоксические и антимикробные антитела /1652к/ Виды антител по РПГА по РА Дизентерийные 3,8 + 0,5 - Зонне 21,2 + 3,2 Коклюшные 716,2 + 105,2 90,2 + 64,4 Дифтерийные 362,9 + 105,7 43,0 + 16,1 Стафилококковые 969,7 + 210,3 238,6 + 128,7 Столбнячные 1823,5 + 211,1 55,7 + 32,2 Будущее покажет, что конкретные числовые значения малоинформативны и подобный подход к оценке иммунного статуса неверен.

Нормальное количество В-лимфоцитов может обеспечиваться совершенно разными сочетаниями АГ-специализированных клеток.

Повышенное количество Тх еще ничего не значит, если не хватает макрофагов и т.д.

Наоборот, малое число Тх может быть идеальным, если снижены Тs. /2338к-5/ Иммунная система имеет территориальные особенности, поэтому показатели кровотока могут не отражать процессы, происходящие в конкретном больном органе. Для ИС характерна высокая мобильность, связанная с тем, что все ее главные компоненты практически всегда находятся (или рабочем) состоянии и определенный уровень активации, вероятно, является нормальным состоянием ИС. В 1987г. Р.В.Петровым сформулирована концепция иммунологических мобилей, сущность которой заключается в том, что под влиянием АГ-ых и неАГ-ых воздействий, непрерывно поступающих во внутреннюю среду организма или в нем возникающих, ИС постоянно меняет свой облик, постоянно меняет уровни своих составных частей (Тх,Тs, контрсупрессоров и т.д.). Поступивший в организм АГ-ый стимул выводит из равновесия практически всю ИС, и она будет 'возмущена' до тех пор, пока не перейдет в новое равновесное состояние. Это состояние сохраняется лишь до тех пор, пока другой стимул не поступит или не возникает в организме. А так как антигенные стимулы поступают в организм непрерывно, то очевидно, что ИС непрерывно меняется и находится в движении. В свете концепции иммунологических мобилей, а также на многоступенчатом уровне регуляции иммунологических процессов по-новому встает вопрос о нормативных параметрах ИС. /2338к/94/ В свете этих особенностей функционирования иммунитета возможны такие ситуации, когда развиваются изменения или нарушения в ИС, которые практически никогда не ведут к возникновению иммунопатологических процессов, так как другие компоненты этой системы берут на себя функции нарушенной структуры.

Примером являются случаи селективного дефицита Ig A при полном отсутствии каких-либо иммунопатологических проявлений. /2338к/94/ С другой стороны, возможно наличие патологического процесса без видимых нарушений в иммунной системе. /2338к/94/ В 1987г. американский иммунолог R.Hong разработал трехэтапную систему оценки ИС. Р.В.Петровым создан 2-этапный принцип оценки иммунного статуса. _Выделяют 3 уровня иммунологических тестов .: 1. Первый уровень.

Первый этап предназначен для выявления 'грубых' дефектов иммунитета с помощью ориентировочных тестов. - Определение лейкоцитарной формулы и общего количества лейкоцитов в периферической крови. - Подсчет относительного и абсолютного количества Ти В-лимфоцитов. - Определение уровня иммуноглобулинов и их субклассов.

Измерение концентрации Ig G, Ig M, Ig A (дефицит Ig A может не сопровождаться патологией. /2338к/94/) - Оценка специфического гуморального ответа (иммунизация с последующим определением уровня АТ). - Оценка фагоцитарной активности лейкоцитов. - Определение активности системы комплемента. - Кожные тесты. - Определение морфологиии лимфоцитов. - Рентгенография и рентгеноскопия лимфоидных органов. 2. Второй уровень. /6812/84/ Тесты 2 уровня обозначают как аналитические. К ним могут относиться практически все тесты, позволяющие оценить функциональную активность клеток. - Определение уровня цитокинов (фактора, ингибирующего миграцию макрофагов /МИФ/, интерлейкинов, ФНО и др.) в крови и в других биологических жидкостях. - Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов (CD-АГ) -- субпопуляций Т-лимфоцитов (хелперы, супрессоры, эффекторы); -- опредение поверхностных иммуноглобулинов различных классов на В-лимфоцитах; -- количественное определение ЕКК. - Оценка развития клеточного и гуморального иммунного ответа. - Определение функциональной активности клеток ИС -- анализ пролиферативного ответа мононуклеарных клеток на Ти В-митогены и специфические антигены (реакция бласттрансформации на митогены: ФГА, Кон А, ЛПС, митоген лаконоса; на митогены в СКЛ), -- оценка функциональной активности В-клеток (фенотип, поликлональная активация, продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro, антиген-специфическая стимуляция, иммунизация убитыми вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ 174), -- анализ цитотоксичности (NK-клетки, Т-киллеры). --- определение активности ЕКК; --- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, поликлональная активация митогенами, антигенами в смешанной культуре лимфоцитов /СКЛ/, тесты Т-хелперной и Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ, цитотоксическая активность, кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин и пр.); -- оценка функциональной активности макрофагов (адгезии и хемотаксиса, стадий фагоцитоза и его завершенности, внутриклеточной инактивация Staphylococcus aureus, тест кожного окна, хемилюминесценции). - Количественное определение отдельных компонентов комплемента (субкомпонента С1q, С3, С6-С8). - Оценка миграционной активности лейкоцитов (макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов). Анализ молекул адгезии. -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА. - Оценка HLA. 3. Третий уровень. - Генетический и цитологический анализ хромосомного материала. - Определение ферментов лимфоцитов (аденозиндезаминаза, пириннуклеозидфосфорилаза), ассоциированных с иммунодефицитами. - Анализ смешанных клеточных культур с целью определения иммуноглобулин-продуцирующей функции В-лимфоцитов. - Гистохимический анализ лимфоидных органов.

Хорошо диагносцируются первичные (врожденные) иммунодефициты, вторичные четко регистрируются при хронических патологических состояниях. В настоящее время нет достаточно универсального набора тестов для оценки первичных и вторичных иммунодефицитов. /6812/84/ Определение уровня иммуноглобулинов не всегда полезно. Для иммунной защиты имеет значение количество специфических антител, а не общая концентрация иммуноглобулинов сыворотки. РАЗДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ (для изучения функциональной активности, определения HLA-АГ) Принципы разделения: По различным адгезивным способностям (АГ-предентирующие клетки - моноциты и В-лимфоциты адгезируют к твердым поверхностям): - к стеклу (стеклянным бусам), клетки отделяют от сорбента встряхиванием), - найлоновая вата в шприце (В-лимфоциты снимают 5-6-кратным сдавлением ваты поршнем шприца) - сефадекс.

Аффинная хроматография основана на избирательной сорбции клеток различных субпопуляций к носителю, содержащему вещества, к которым клетки данной субпопуляции имеют высокое сродство (АГ, мембранные Ig, через 'пришитые' FcR, белок А стафилококков, CR1). - Желатин смешивают с АГ, покрывают центрифужные пробирки + суспензию лимфоцитов. С АГ связываются АОК --- нагрев до 37оС выход АОК. - Эритроциты нагружают белком А стафилококка + суспензия лимфоцитов --- связывание зрелых В-лимфоцитов.

Элюция гипотоническим раствором или лизостафином. - Монослой эритроцитов, нагруженных ИК + суспензия лимфоцитов.

Свободные В-лимфоциты получают гипотоническим шоком. - Через CR1 В-лимфоцитов (на сефарозе-С3) - Аффинная хроматография на колонках с лектинами; элюция раствором углевода, по отношению к которому лектин специфичен (отделение агглютинированных клеток центрифугированием). Связывание лектина Helix pomatia Т-лимфоцитами на колонке (лектин связывает обработанные нейраминидазой Т-лимфоциты); Клетки элюируют N-ацетил-D-галактозамином.

Очищенные Т-лимфоциты можно получить путем отрицательной селекции HLA-DR положительных клеток (т.е. В-лимфоцитов), разрушая их соответственно антисывороткой и комплементом.

Распределение Ти В-лимфоцитов в организме и их характеристика Показатель Т-лимфоциты В-лимфоциты Источник Костный мозг Костный мозг Место формирования Тимус Красный костный мозг Группы лимфоидных фолликулов Распределение , % : Красный костный мозг 0 15 Тимус 100 (тимоциты) 0 (0,3) ЛУ 60 (65) 20 (21) Пейеровы бляшки 30 60 Селезенка 30 (35) 60 (42) Кровь 60 20 (15) Лимфа 85 15 Наличие АГ CD4+,CD8+ CD19+ и др. HLA I класса I и II классов Локализация - в ЛУ Паракортикальная Центры размножения зона, (зародышевые центры), перифолликулярное медуллярные тяжи пространство - в селезенке Белая пульпа, окруКрасная пульпа, жающая артериолы центры размножения - в пейеровых Перифолликулярная Центр фолликула бляшках зона Рециркуляция в организме Быстрая Менее быстрая Продолжительность жизни Месяцы Недели Поверхность Гладкая Ворсинчатая Рецепторы к ЭБ (Е-РОК) (эритроцитам барана=Е) + - Рецепторы к С3в (ЕАС-РОК) - + FcR - + Стимуляция синтеза ДНК - митогены микробного происхождения - ЛПС Гбактерий - + - туберкулин - /?/ + /2551к/98/ - митогены животного происхождения - анти-Ig - + - смешанная культура лимфоцитов (СКЛ) - + (АПК на HLA) - митогены растительного происхождения (лектины) - ФГА +(для Тs) - - Кон А +(для Тs) - _- митоген лаконоса . _ + . _ + - джекалин + связывает Ig A (используется для выделения В-клеток на колонке) Связывание лектина Helix pomatia + - Чувствительность к кортикостероидам Высокая Низкая (Л 96 ) Функции 1.Участие в реакциях 1.АТ--образование клеточного типа 2.Регуляция ИО (Тк) (В-лимфоцитыАПК 2.Иммунорегуляторная = АГ-презентирую- (Тх, Тs) щие клетки) 3а. Д-лимфоциты - двойные лимфоциты, несущие на своей поверхности маркеры Ти В-лимфоцитов. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ (количественный аспект; без разделения) I. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ МЕМБРАНОЙ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ /метод МИФ/ Анализ поверхностных маркеров субпопуляций лимфоцитов, (хелперы, супрессоры, эффекторы). 1ЕКК (CD3- _CD56+ .), В-клетки (СD19+) Т-лимфоциты ( _ СD3+ . ,CD56-) - Образует комплекс с рецептором для АГ. Тх - CD4+ Ts,Tk - CD8+. Выделение лимфоцитов на фиколе --- мазок --- высушивание --- фиксация --- обработка МАТ к определенному АГ --- обработка антисывороткой к МАТ (к Fc-фрагменту), меченых флюорохромом --- микроскопия под люминисцентным микроскопом. (Или в пробирке смешать суспензию лимфоцитов с МАТ --- мазок) _Определение субпопуляции лимфоцитов с помощью МАТ (моноклональных антител) методом непрямой поверхностной иммунофлуоресценции Для постановки этой реакции в центрифужную стеклянную пробирку вносят 500 тысяч лимфоцитов, выделенных в градиенте фиколл-верографин. К 30 мкл суспензии клеток добавляют 20 мкл готового коммерческого раствора МАТ, осторожно перемешивали и инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре. После инкубации к лимфоцитам добавляли 1 мл раствора Хенкса, перемешивали легким покачиванием пробирки и центрифугировали 2 - 3 минуты при 1200 об./мин.

Надосадочную жидкость осторожно сливали, а оставшиеся капли среды убирали фильтровальными полосками. В пробирку к отмытым клеткам вносят 20 мкл вторых (антимышиных) антител, меченных ФИТЦ (FITC anti Mi), нежно перемешивают и помещают в рефрижератор при 4 о С на 30 минут. После реакции лимфоциты дважды отмывают раствором Хенкса и к осадку клеток добавляют 50 мкл того же раствора, клетки ресуспендируют легким покачиванием пробирки.

Суспензию клеток переносят в лунки парафилма на сухое предметное стекло, предварительно обработанное в 0,005% растворе poly-L-lysine (Sigma), и инкубируют там в течение 20 мин при комнатной температуре. После адгезии клеток к стеклу осторожно полосками фильтровальной бумаги убирали среду и вносили по 20 мкл 50%-го раствора глицерина. При люминесцентной микроскопии использовали объектив микроскопа х90, окуляр х10. Оценку реакции осуществляли по проценту светящихся клеток.

Характеристика моноклональных антител в реакции непрямой поверхностной иммунофлуоресценции Моноклональное Изотип Клон Молекулярная Специфичность антитело масса антигена DT-Anti-CD 3 IgG 2a ICO 90 26,20,16 кДа Зрелые Т-лимфоциты DT-Anti-CD 4 IgG 1 ICO 86 56 кДа Зрелые Т-хелперы/ индукторы DT-Anti-CD 8 IgG 1 ICO 31 32 кДа Супрессорные/ цитотоксические (киллерные) лимфоциты DT-Anti-CD 16 IgG 1 ICO116 50-65 кДа NK-клетки, гранулолоциты, макрофаги DT-Anti-CD 22 IgG M ICO 91 140 кДа В-лимфоциты II. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОГО КОЛИЧЕСТВА СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК Подсчитать относительное количество Ти В-лифоцитов в готовых мазках.

Сделать заключение о наличии иммунодефицита. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛИМФОЦИТОВ МЕТОДОМ РОК В крови - 60-80% Е-РОК, в лимфе - 95%, в ЛУ - 65-70%, в селезенке - 35-40%, в тимусе - более 95%. Данный тест - мера количества, а не функциональной активности клеток. /6504/90-?/ CD2 - рецептор для эритроцитов барана. При смешивании суспензии лимфоцитов с эритроцитами барана последние приливают к ним, образуя т.н. 'розетку'. Процент розеток с эритроцитами барана /ЭБ/ по отношению к общему количеству лимфоцитов, оцениваемое при проведении микроскопии, отражает относительное число _Т-лимфоцитов (Т-РОК . = Т-розеткообразующая клетка). - Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%. - Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%. Количество Т-лимфоцитов (Е-РОК) - в крови - 60 (80)%, - в лимфе - 95%, - в ЛУ - 65-70%, - в селезенке - 35-40%, - в тимусе - более 95%. CD2 Т CD2 FcR В СR1 _Определение Т-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК). С этой целью лимфоциты человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 6 в 1 мл предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в различной конечной концентрации при температуре 37С в течение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования осадок ресуспендировали и подсчитывали процент 'активного' розеткообразования Т-лимфоцитов с эритроцитами барана. Для определения общего числа Т-лимфоцитов лимфоцитарно-эритроцитарную взвесь оставляли при температуре 4 о С в течение 2-х часов, после чего подсчитывали в камере Горяева процент розеткообразующих клеток. - Теофиллин-резистентные Е-РОК (Тх) - 50-63%. - Теофиллин-чувствительные Е-РОК (Тs) - 17-20%. _Определение В-лимфоцитов . осуществляли с помощью розеткообразования с эритроцитами барана, обработанными антителами и комплементом. В этом случае также лимфоциты человека, взвешенные в среде 199, в концентрации 2 х 10 6 в 1 мл предварительно инкубировали с исследуемыми образцами полипептидов в различной конечной концентрации при температуре 37 о С в течение 1 часа. После инкубации к 0,1 мл взвеси лимфоцитов добавляли 0,1 мл 1% взвеси отмытых эритроцитов барана, обработанных антителами и комплементом,центрифугировали в течение 5 минут при 1000 об/мин. После центрифугирования и повторной инкубации при температуре 37 о С в течение 30 мин. осадок ресуспендировали и подсчитывали процент розеткообразующих клеток.

Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в периферической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах. Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ, и в меньшй степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и кролика. При 45 о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ Оптимальная температура - 4-18 о С (При 37 о число розеток снижается до 20%). /6504/90-?/ _В-лимфоциты ., имеющие FcR и рецепторы к С3-компоненту комплемента (CR1), образуют розетки с эритроцитами барана, обработанными антителами к ним и сывороткой мыши (как источника комплемента). Также подсчитывается процент РОК по отношению к 100 лимфоцитам ( _В-РОК .). В крови В-лимфоцитов - 15% (10-25%). Рецептор к ЭБ имеется на тимоцитах, Т-лимфоцитах (в периферической крови - 60-79% Е+ клеток), тромбоцитах, гранулоцитах. Т-лимфоциты практически все без исключения связываются с ЭБ, и в меньшей степени с эритроцитами козы, крысы, морской свинки и кролика. При 45о происходит обратимая утрата рецепторов к ЭБ Оптимальная температура - 4-18оС (При 37о число розеток снижается до 20%). /6504/90-?/ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ СУБПОПУЛЯЦИЙ ЛИМФОЦИТОВ Определение активности лимфоцитов - реакция БТЛ в ответ на митоген лаконоса. (функциональный аспект) Др. функциональные тесты (экспрессия рецепторов к определенным регуляторам и пр.) Определение HLA (по В-лимфоцитам , имеющим и I, и II класс антигенов HLA ) К суспензии лимфоцитов добавляют в 100 лунках по трафарету МАТ к определенному HLA. В 6-12 лунках из 100 происходит образование ИК, которые выявляют последующим добавлением комплемента (ксеногенной сыворотки). Под микроскопом определяют лунки с разрушенными лимфоцитами. Если лимфоциты целы, то данного АГ у человека нет. [Из фракции лимфоцитов выделяется В-субпопуляция на нейлоновой вате; срывается с нейлона. HLA определяется по В-лимфоцитам, т.к. на них имеется HLA и I, и II классов.] Из гепариновой крови человека выделяют лимфоциты (аналогично методике определения РОК), раскапывают по 1 мкл в примерно 100 лунок планшетки. В каждую лунку добавляют МАТ (1 мкл) к соответствующему АГ и 1 мкл кроличьего комплемента (цельную сыворотку). 1 час. 37о.

Добавляют эозин, формалин.

Планшетку ставят под микроскоп и определяют лунки с деструктированными лимфоцитами, т.е. с АГ человека. Если в данную лунку добавлялись МАТ к А8 и у человека имеется HLA А8, то антитела связываются с лимфоцитом, т.е. образуется ИК, который активирует систему комплемента и МАК разрушает лимфоцит. ОЦЕНКА ГУМОРАЛЬНОГО ИММУНИТЕТА - Подсчет относительного и абсолютного _количества . В-лимфоцитов. - Развитие гуморального _иммунного ответа -- после иммунизации АГ-ом. - Определение функциональной _активности . В-клеток: -- фенотип, -- поликлональная активация - пролиферация мононуклеарных клеток в культуре клеток на среде 199 (реакция бласттрансформации на митогены: ЛПС, на митогены в СКЛ), -- антиген-специфическая стимуляция (иммунизация убитыми вирусными вакцинами, гемоцианином или бактериофагом ФХ 174), -- продукция иммуноглобулинов в культуре in vitro, -- оценка _миграционной активности . (с помощью миграция-ингибирующего фактора = МИФ). - Определение медиаторов гуморального иммунного ответа в крови и тканях ( _уровень ИЛ-1,2,6,4 .). - Оценка функциональной _активности Т-регуляторов . (фенотип, поликлональная активация митогенами, тесты Т-хелперной и Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ). - Определение поверхностных иммуноглобулинов различных классов на В-лимфоцитах (МИФ и др.). - Общий уровень (нормальные, анамнестические АТ) иммуноглобулинов ( _Ig М.G,A .); -- ракетный электрофорез (ЭФ) -- реакция преципитации (РП) по Манчини -- РПГА. -- Уровень специфических АТ --- определение титра АТ у больного к определенному инфицирующему агенту (прямая и развернутая РА, РСК): столбнячных, дифтерийных, стафилококковых, коклюшных, дизентерийных и др. антител. - Определение морфологиии лимфоцитов (должны быть шероховатыми) МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ /259,2551к/ Методы Чувствительность методов (выявляемое количество антител, г/мл) РА (реакция агглютинации) 10 -6 -10 -7 - сальмонелл 10 -6 - пневмококков 10 -2 РГА (реакция прямой гемагглютинации) 10 -4 РПГА (реакция пассивной гемагглютинации) 10 -7 - 10 -9 - Реакция Кумбса 10 -7 Реакция коагглютинации (РКОА) 10 -8 -10 -9 РП (реакция преципитации) - в геле 10 -2 -10 -3 - кольцепреципитация 10 -3 - нефелометрия, турбидиметрия - колориметрия (с реактивом Фолина) - встречный иммуноэлектрофорез /ИЭФ/ 10 -6 -10 -7 Реакция иммунофлюоресценции (ИФМ) 10 -7 РЭМА 10 -9 и менее РИМ 10 -9 и менее Иммуноблоттинг (вестерн-блот) 10 -7 -10 -9 РСК (реакция связывания комплемента) 10 -6 Реакция иммунного лизиса 10 -8 -10 -9 РН (реакция нейтрализации) 10 -4 -10 -6 Реакции анафилаксии, кожная проба нейтрализации токсина (in vivo) Выявлена негативная корреляция между Ig M и альфа-2-макроглобулином (r=-0,85) и максимальная позитивная корреляция (r=0,87) между Ig M и , бета-2-гликопротеином и C3а-активатором и церулоплазмином.

Максимальному уровню Ig G соответствовали и максимальные уровни других белков (комплемента, С1-инактиватора,альфа-1-антитрипсина, альфа-2-макроглобулина и пр.), что дало основание предположить наличие конституционных типов организма по белково-синтетической функции.

Способы получения антител I. Иммунизация (in vivo) Иммунизация человека или животных с последующим получением - цельной сыворотки - гипериммунной сыворотки - гамма-фракции (гамма-глобулинов) Используют по жизненным показаниям.

Недостатки антисывороток: Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни концентрировали, содержит набор различных антител.

Поэтому ее называют поликлональной. Лишь небольшая часть антител направлена против специфичных антигенных детерминант, а остальные реагируют с самыми разными антигенами. Этим объясняются многочисленные 'перекрестные' положительные реакции, которые приводят к ошибочным диагнозам. Еще один серьезный недостаток: для получения антител каждый раз необходимо заново иммунизировать животных и очищать выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег. Этапы получения антисывороток 1. Иммунизация Один объем антигена смешивают с 3 объемами полного адъюванта Фрейнда и тщательно перемешивают.

Иммунизируют подкожно в складку кожи на шее. Через 10 суток делают пробное кровопускание и определяют качество антисыворотки. При неудовлетворительном качестве индивидуальной антисыворотки иммунизируют новую группу кроликов или животных другого вида. /6817/84/ 2. Адсорбция (очистка) и тестирование - высаливание (осаждение сульфатом натрия или сульфатом аммония) - осаждение спиртом - аффинной хроматографией - обработкой полиэтиленгликолем - каприловой кислотой - выделение на белок А-сефарозе 3. Фракционирование II. MAT (in vitro). Получение МАТ (гибридомная технология) а) В-лимфоциты + вирус Эпштейна-Барра --- быстро перестают синтезировать АТ б) В-лимфоциты + миеломная лимфоцитарная клетка --- гибридома (под действием ПЭГа). МАТ с запрограммированной специфичснотью впервые получили аргентинец Ц.Мильштейн (C.Milstein) и мюнхенец Г.Келер (G.Kohler) /Nature. - 1975. - V.256. - P.495-497/, за что получили в 1978 году Нобелевскую премию. Они рассчитывали использовать гибридомы лишь для изучения генетики антител, а результат привел к подлинному буму. В основу метода положен давно известный принцип гибридизации (слияния) соматических, неполовых, клеток с последующим выделением и культивированием необходимого гибридного клона. Для слияния используют клетки двух видов.

Однако в пробирке эти клетки существуют лишь несколько дней.

Образовавшийся при слиянии двух клеток гибрид наследует признаки обоих 'родителей'. Получение гибридом включает 6 основных этапов. 1. Иммунизация, многократное введение мышам или крысам антигена, против которого необходимо получать антитела. 2. Слияние иммунных лимфоцитов селезенки животного с его же опухолевыми клетками. Для соединения клеток используют обычно полиэтиленгликоль, разрушающий поверхностиные мембраны и способствующий соединению клеток. 3. Отбор гибридов.

Клетки культивируют в среде, содержащей гипоксантин.

Антиген прикрепляют к какому-либо носителю,например, к пластиковым шарикам или пленке. Такой иммобилизованный антиген обрабатывают культуральной жидкостью, в которой растут гибридомы, а затем наносят меченые антитела против мышиных или крысиных гибридомных антител (их метят радиоактивными, флуоресцентными или ферментными метками). Иными словами, проводят анализ культуральной жидкости на присутствие антител к искомому антигену. Если гибридомы производят антитела, то они осядут на антигене, а к тем, в свою очередь, прикрепятся меченые антитела. В результате метка соединится с антигеном на носителе и зафиксируется. 5. Клонирование. Для этой цели несколько гибридных клеток переносят на питательную среду таким образом, чтобы они росли на достаточном расстоянии друг от друга. Через несколько дней вокруг каждой образуется колония дочерних клеток. Это и есть гибридома.

Клетки колонии снова разводят и помещают на питательную среду, чтобы устроить новые колонии.

Клонирование повторяют 3-4 раза, после чего получается устойчивая и продуктивнаялиния клеток. 6. Повторный скрининг и получение специфических моноклональных антител. Эти антитела можно выделить из питательной среды в искусственных условиях или непосредственно из животных, привитых гибридомными клетками (как и многие злокачественные опухоли, гибридому можно прививать). _Преимущества МАТ .: 1. Главная особенность МАТ - чрезвычайная моноспецифичность (против одной антигенной детерминанты) и абсолютная однородность. 2. Возможность многократного получения в течение длительного времени (воспроизводимость). 3. Неограниченное количество получаемых антител. 3. По специфичности и чувствительности МАТ достигают значений, предельных для живой природы.

Отсюда возможность использования для анализа антигенов не высокой степени чистоты. К настоящему времени получены тысячи разнообразных МАТ. МАТ предполагается использовать в лечебных целях в качестве целенаправленных носителей, в состав которых будут включены токсины (рицин и пр.) или другие фармакологически активные препараты. Такие конъюгаты можно использовать в химиотерапии опухолей и при трансплантации органов и тканей (введением МАТ против ОКТ 4,8,11; через 13 суток вырабатывались АТ на введенные МАТ)./6815,6816/ _Недостатки МАТ .: 1. Одна из проблем, связана с тем, что МАТ - продукты мышиных гибридом. В настоящее время разрабатываются способы получения человеческих МАТ. 2. Реакции лишь с одной антигенной детерминантой и отсутствие перекрестных реакций с другими детерминантами на одной молекуле антигена.

Недостаток МАТ - отсутствие преципитационных свойств, в связи с чем чаще всего в тестах используются смеси моноклональных антител. 3. Возможность непредсказуемых пекрестных реакций с полифункциональными антигенными детерминантами. 4. Вследствие этого - низкий аффинитет МАТ. _Исследование влияния на антителообразование Для изучении влияния фармакопрепаратов на первичный иммунный ответ животным вводят вещество (допустим, кордиалин в физиологической дозе 0,15 мг/кг в течении 3 недель 3 раза в неделю). Контрольная группа должна получать такое же количество физиологического раствора.

Допустим, на 14-е сутки, после первого введения, животных иммунизируют эритроцитами барана в дозе 108 клеток на мышь (внутрибрюшинно). На 20-е сутки эксперимента в реакциях гемагглютинации и гемолиза можно определить титр гемагглютининов и гемолизинов. В селезенке животных оценивают количество антителообразующих клеток (АОК) по методу A.Cunningham (1965), сравнивая их количество в опыте и контроле.

Коэффициент стимуляции антителообразования в обеих сериях рассчитывают по отношению количества АОК, приходящихся на 106 ядросодержащих клеток в опыте, к соответствующему количеству АОК в контроле.

Литература: Зимин ... Лабораторное дело. - 1984. - N 9. - С.556. ОЦЕНКА КЛЕТОЧНОГО ИММУНИТЕТА - Подсчет относительного и абсолютного _количества . Т-лимфоцитов.

Персистирование высоких количеств CD8-клеток может указывать на хроническую вирусную инфекцию. /1575к/90/ Количество СD4 + -клеток снижается при СПИДе. - Определение медиаторов клеточного иммунного ответа /ИО/ в крови и тканях (ИЛ-2). - Развитие клеточного _иммунного ответа .. - Определение функциональной _активности . иммунокомпетентных клеток: -- оценка функциональной активности Т-клеток (фенотип, поликлональная активация митогенами, антигенами в смешанной культуре лимфоцитов /СКЛ/, тесты Т-хелперной и Т-супрессорной активности, антиген-специфический ответ, цитотоксическая активность, кожные тесты ГЗТ на туберкулин, стрептокиназу, кандидин и пр.), -- пролиферация мононуклеарных клеток (реакция бласттрансформации на митогены: ФГА, Кон А, митоген лаконоса /на Ти В-лимфоциты/), -- тест торможения миграции лейкоцитов на ФГА. - Определение ферментов лимфоцитов. - Определение морфологии лимфоцитов. ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИХ СОСТОЯНИЙ Иммунопатологические состояния проявляются - повышенной реактивностью - сниженной реактивностью (иммунодефицитами). Возможно сочетание данных состояний (в старости), разная реакция на разные АГ. Поэтому данные два противоположных состояния можно лечить одними и теми же иммуномодуляторами (имммуностимуляторами). Иммунопатологические состояния проявляются развитием преимущественно 4 основных синдромов: - аллергического синдрома (ГНТ-1) - аутоиммунного синдрома (ГНТ-2) - инфекционного синдрома (ИД) - лимфопролиферативного синдрома (недостаточность ИД апоптоза-?) ВЫЯВЛЕНИЕ ИММУНОДЕФИЦИТОВ (+ см. ИД в лекции по иммунопатологии) - Снижение функциональной активности лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов -- сниженный уровень антител. - Снижение количества иммунокомпетентных клеток. - Падение комплементарной активности. - Сниженная реакция лимфоидных органов на инфекцию (незначительное увеличение ЛУ на локальный воспалительный очаг). - Кожный тест с пирогеналом.

Внутрикожно вводят пирогенал и измеряют величину возникающей эритемы. При ее размере 4-10 мм диагносцируют нормальную реактивность.

Значения, выходящие за рамки этих пределов, трактуются как сниженные или повышенные. /1652к/ Диагностика недостаточности Т-системы иммунитета Клиническая картина нет да Кожная реакция на туберкулин нет отрицательная Индекс стимуляции лимфоцитов Кон А или ФГА менее 15 более 15 Вспомогательные клетки менее 400/мл нет более 400/мл Соотношение лимфоцитов с CD 4/CD 8 более 1 менее 0,8 Недостаточность Т-системы иммунитета ВЫЯВЛЕНИЕ СОСТОЯНИЯ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ Основным методом диагностики ГНТ является сбор 'аллергологического' анамнеза, основной задачей которого является выяснение связи заболеваний с наследственной предрасположенностью и действием аллергенов внешней среды. ГНТ 1 типа.

Анамнез отягощен и есть связь заболевания с аллергенами. ГНТ 2 типа. То же, но связь не выявляется.

Необходимо специфическое обследование. ГНТ 3 типа.

Анамнез не отягощен и нет влияния аллергенов. В обследовании аллергологов не нуждается.

Обследование больных с ГНТ использует те же приемы и методы, что и при других заболеваниях, т.е. - общий осмотр, - объективное обследование по органам и системам, - специфическая лабораторная диагностика. /2300к/ _Диагностика с использованием кожных проб .. Время реакции - при ГНТ 1 типа через 1-30 минут.

Реакция обусловлена антителами класса Ig E. - при ГНТ 3 типа реакция через 4-12 часов (с участием иммунных комплексов, содержащих Ig M, Ig G). - при ГЗТ 4 тип (Тк) - через 24-48 часов. _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ I ТИПА Основная черта аллергического статуса является чувствительность к аллергенам экзогенного происхождения.

Аллергологическое обследование включает 2 вида методов: 1. Провокационные тесты (кожные пробы). 2. Лабораторные методы. - Выявление анафилатоксинов (профилактика анафилатоксического шока) ( Клиническая диагностика. ) В острый период аллергического заболевания специфические методы отрицательные, а использование аллергенов может усилить обострение, поэтому специфическое обследование проводят в период ремиссии.

Диагностические критерии аллергии - наличие характерных анамнеза (наследственной предрасположенности и пр.) и клинических проявлений - пароксизмальное приступообразное течение и быстро наступающая ремиссия при элиминации аллергенов или провоцирующих факторов, наоборот, резкое их обострение при повторном воздействии. - эозинофилия крови, мокроты, секретов и других биологических жидкостей и выделений - характерное поражение тканей при местном аллергическом процессе - положительные кожные пробы со специфическим аллергеном - положительные провокационные тесты с аллергенами или причинными факторами - наличие в значительном количестве специфических Ig E-антител в сыворотке крови и секретах, увеличение уровня неспецифических Ig E, выявление Ig G4, обнаружение пассивно-сенсибилизированных ТК, базофилов и других лейкоцитов (нейтрофилов) - выявление аллерген-специфических лейкоцитов - положительные провокационные тесты на медиаторы аллергии (гистамин и др.) - эффективность специфической и неспецифической антиаллергической терапии (антигистаминные препараты, КС и др.). /2300к/ Биологическая диагностика . Правила постановки кожных проб. - Кожные пробы ставятся в период ремиссии (через 1-2 недели после обострения). При этом должны быть в наличии -- средства оказания неотложной помощи, -- противошоковый набор. - У аллергена должны отсутствовать токсические свойства, доза и объем минимальны. - Перед постановкой пробы берут кровь для лабораторного исследования, так как возможна дисенсибилизация. - Пробы не ставят с веществами, в ответ на которых был шок. - Адекватный набор кожных проб и правильная последовательность их применения (от менее чувствительной, но более безопасной /накожной/ к более чувствительным /внутрикожной/ и опасной). /2300к/ Противопоказания для проведения кожный проб . 1. Острый период аллергического или любого другого средней степени тяжести или тяжелого заболевания. 2. Во время беременности, кормления ребенка и в первые 2-3 дня менструального цикла. 3. Присутствие убедительного анамнеза. /2300к/ Интерпретация результатов кожных проб . _1. Ложноотрицательные бывают - при угнетении кожной реакции на фоне приема антигистаминных препаратов, бета-адреномиметиков, кортикостероидов, у детей до года и пожилых людей (ИД), - недостаточной чувствительности кожи (слабая фиксация аллергена) - при низкой концентрации аллергена - при десенсибилизации на аллерген (при постоянном контакте с ним). /2300к/ _2. Ложноположительные реакции могут быть - при псевдоаллергических реакциях, если вводимый препарат обладает раздражающими свойствами - при постановке проб в острый период аллергической реакции, когда кожа повышенно реагирует на раздражитель - при введении внутрикожно больших объемов растворов, вызывающих дегрануляцию ТК от сдавливания тканей. - при недостаточной частоте аллергена в наличии в нем примеси других веществ, вызывающих аллергическую реакцию. /2300к/ Лабораторная диагностика . _1) Анализ крови Важным признаком аллергии является эозинофилия (увеличение на 2-4% от нормы или более 500 в 1 мкл крови). _Гиперэозинофилия . наблюдается также при паразитарных инвазиях, эозинофильных инфильтратах легкого и кишечника, коллагенозах, эозинофильных лейкозах, лимфогранулематозе, введении эстрогенов и андрогенов, блокаде бета-рецепторов.

Глюкокортикостероиды, наоборот, приводят к исчезновению эозинофилов. /2300к/ _2) Определение антител в сыворотке крови больных - реакции преципитации, РНГА (РПГА). - ИФМ (иммуно-флюоресцентный метод), - Радио-аллергосорбентный тест. /2300к/ - Антиглобулиновые реакции (со специфическим аллергеном). /2300к/ 3 _) Определение гистамина .. Непрямой и прямой тест дегрануляции базофилов и тучных клеток (ТК). /2300к/ 4) Определение простагландинов, _лейкотриенов .. /2300к/ 5) Определение функционального состояния системы гипофиз-кора надпочечников. /2300к/ 6) Реакция _агрегации тромбоцитов .. /2300к/ а) При лекарственной аллергии: - ускорение СОЭ - лейкопения - тромбоцитопения - агранулоцитоз - гемолитичиеская анемия. /2300к/ б) При бронхиальной астме - в мокроте обнаруживаются кристаллы Шарко-Лейдена, эозинофилия (в мокроте) (без увеличения количества микробов). /2300к/ - рентгеноскопия, рентгенография, эндоскопический и эхографический методы диагностики. /2300к/ Кожные пробы. 1) _'Проба на эозинофилы' .. Сравнивается число эозинофилов в капле крови, полученной из очага кожной реакции и в симметричном участке нормальной кожи. При увеличении их числа в пораженном участке более чем на 10% заболевание считается аллергическим. /2300к/ 2) ' _Проба на ТК . (тучные клетки)'. Дермографизм отражает реактивность кожи, ее капилляров и ВНС. Его оценивают на коже груди, живота или спины после проведения нескольких полос тупым твердым предметом.

Иногда используют специальные дермографы, позволяющие оценить силу надавливания на кожу.

Обычно через 15 секунд появляется эритема по линии надавливания, а затем возникает отечность. В норме линия надавливания слабая или умеренная, красная быстро исчезает.

Уртикарный слой в виде отечных белых полос наблюдается при мастоцитозе (пигментная крапивница), повышенной лабильности нервной системы, некоторых аллергических заболеваниях (атопическом дерматите), появляется сразу после надавливания на кожу и может сохраняться от 30 минут до суток, сопровождаться зудом. /2300к/ - _Реакция Праустница-Кюстнера . - реакция пассивного переноса сенсибилизации (перенос сывороткой крови здоровому человеку). На первом этапе несенсибилизированному реципиенту вводят внутрикожно в предплечье 0,05-0,1мл сыворотки крови больного аллергией в несколько точек на расстоянии не менее 6 см. Затем через 24-48 или 72 часа в эти места, а также в участки введения антисыворотки (самого реципиента) и разводящей жидкости (контроль) делают внутрикожно разрешающую инъекцию аллергена по 0,02 мл (на расстоянии 0,5-1 см от точки введения сыворотки). В одно из мест введения сыворотки крови больного вместо аллергена вводят его растворитель (контроль). Реакция возникает в случае взаимодействия антител введенной сыворотки крови больного и аллергена. Ее результат учитывют через 20 мин после иньекции аллергена, так же как в/к пробу. Если использовать разведенную сыворотку, то можно определить ее титр.

Минимальное время, необходимое для фиксации реагинов, составляет 3 ч.

Однако в связи с возможностью переноса вирусного гепатита и СПИДа, а также с наличием других методов диагностики в последнее время реакция утратила свое значение. Более приемлемо ее применение в комбинации 'больной ребенок - реципиент один из родителей'. Иногда аллерген вводят не в/к, а через рот (например, пищевой продукт). 3) _Пробы на аллергены . (аллергические пробы). Недостаток - добавочная аллергизация организма. -- конъюнктивальные -- назальные -- ингаляционные -- кожные (скарификационные, внутрикожные, пробы уколом, накожные /капельные, аппликационные, компресные, электрофоретические/) /2300к/, -- экспозиционные -- подъязычные -- пероральные (с регистрацией по изменению картины крови /лейкопенические, тромбоцитопенические, эозинофилоцитопенические/, по подавлению миграции лейкоцитов in vivo в коже или слизистых, по изменению функции внешнего дыхания). В основе провокационных тестов лежит специфическая вторичная повышенная иммунная реакция на вводимый в организм аллерген. /2300к/ Различают аллерген-специфические и неспецифические провокационные тесты. - _Специфические . основаны на вызове аллергической ответной реакции шоковых тканей и органов к специфическим аллергенам и регистрация результатов этих реакций по ряду показателей. /2300к/ - _Неспецифические . тесты позволяют выявить состояние гиперчувствительности различных тканей к медиаторам аллергической реакции (гистамину, АХ-ну, брадикинину, серотонину, простагландинам и другим) или неспецифическим раздражающим факторам (холод, физическая нагрузка и др.). /2300к/ -- Ингаляционные с бронхоконстрикторами (с медиаторами /гистамин, АХ, Pg F 2-альфа , брадикинин, серотонин/, с неспецифическими раздражителями /холодный воздух, физическая нагрузка/). /2300к/ -- Ингаляционные с бронходилататорами (селективными стимуляторами бета-2-адренорецепторов /беротек/, с холинолитиками /атропин или атровен/, с ингибиторами фосфодиэстеразы /теофиллин, эуфиллин/, с медиаторами /Pg E/). /2300к/ -- Кожные неспецифические (с медиаторами /гистамин/, дермографизм). /2300к/ Количественные тесты указывают на степень чувствительности к аллергену или фактору, а качественные - на специфичность реакции. _ Профилактика и лечение . аллергий Гипосенсибилизация более 70 лет является основой лечения аллергий респираторного тракта. _1. Препараты, оказывающие действие на иммунную стадию - Влияющие на процесс образования Ig E. /2275к/ -- повторное введение увеличивающихся доз аллергена (запуск синтеза Ig G 6 блокада АГ до подхода к ТК) (получение чистых индивидуальных аллергенов --- преры- +- вистые повторные инъекции экстратов АГ на адъювантах; повышение интервалов между инъекциями) -- введение per rectum (запуск пероральной толерантности) -- индукция иммунологической толерантности (супрессией синтеза Ig E адъювантом Фрейнда; переводом АГ в толерантную форму, т.е. формирование клеток-супрессоров) - Влияющие на связывание Ig E c Fc(Е)-рецепторами. /2275к/ -- введение Fc-фрагмента Ig E -- введение 1-валентного аллергена -- введение анти-Ig E -- модификация антигенных детерминант аллергена - Регуляция гамма-ИФ-ом: ИФ является прямым антагонистом ИЛ-4 в ИЛ-4-индуцированной продукции Ig E. /2262к/98/ - Влияющие на синтез ИЛ-ов, участвующих в Ig E-ответе. /2275к/ -- ИЛ-10 (предотвращающего ИЛ-4-индуцированный синтез Ig E путем ингибиции вспомогательной функции моноцитов) . /2262к/98/ -- ИЛ-12, регулирующего уровень секреции ИФ-гамма, ИЛ-4 и ИЛ-10 антигенспецифическими лимфоцитами. /2262к/98/ - ИЛ-8 селективно ингибирует Ig E-продукцию ПК-ми, индуцированными ИЛ-4-ом . /2262к/98/ _2. Препараты, оказывающие действие на патохимическую стадию. - Стабилизаторы мембран клеток-мишеней аллергии. /2275к/ -- гормональная терапия (преднизолон и пр.), -- препараты кетотифен, промогликат-? Nа --- стабилизация мембраны ТК. - Соединения, тормозящие активацию этих клеток (влияющие на поступление и либерацию ионов кальция, на синтез и обмен медиаторов аллергии, на систему аденилатциклаза-цАМФ-фосфодижстераза). /2275к/ -- группа кромолинов (кромогликат натрия - интал) угнетает освобождение медиаторов из ТК. /2275к/ _3. Препараты, оказывающие действие на патофизиологическую _стадию. /2275к/ - Антагонисты медиаторов аллергии (гистамина, серотонина, ЛТ-ов, ФАТ). /2275к/ -- антигистаминные средства (цетиризин = зиртек) /2275к/, -- бронхолитики, - Соединения, снижающие чувствительность эффекторных тканей к аллергии (стимуляторы бета-адренорецепторов, альфа-адреноблокаторы, ингибиторы М-холинорецепторов). /2275к/ 4. Препараты, оказывающие действие одновременно на различные стадии аллергического процесса - _полифункциональные (глюкокортикостероиды, кетотифен). /2275к/ _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ II ТИПА Аутоиммунными принято считать те заболевания, в основе которых лежит иммунная реакция на собственные антигены тканей и органов.

Причины и механизмы заболевания - Измененные собственные АГ. -- Индуцированный вирусами и другими агентами мутации и модификации активности аутогенов - онкогенов, регулирующих продукцию цитокинов и их рецепторов. - Нарушение барьеров 'забарьерных органов' или физиологически изолированных АГ-ов. - Нарушение распознавания 'своего' и 'чужого' (данные иммуногенетики). -- Антигенная мимикрия аутоАГ и АГ микробов. - Активация аутоактивных клонов лимфоцитов -- снижение функции клеток-супрессоров. -- снижение апоптоза Тх, активирующих В-лимфоциты (CD5). /2300к/ - Нарушение иммунологической сети идиотип-антиидиотип (выявление свободных антиидиотипических антител). - Индукции экспрессии HLA DR-антигенов, их не имевших, Диагностика Диагноз аутоиммунных заболеваний может быть поставлен на основании клинической картины заболевания, лабораторных показателей.

Критерии аутоиммунных заболеваний . - Наличие четких доказательств участия АТ в поражении клеток (наличие аутоантител различной специфичности), - положительный клинический эффект от лечения иммуномодуляторами - эффективность десенсибилизации. /2300к/ Анализ крови : - снижение Т-клеток (особенно Тs), - увеличение числа В-лимфоцитов - поликлональная гиперили дис-иммуноглобулинемия - ИК в крови - снижение концентрации комплемента /? - ПОЛ/ (- определение уровня ИЛ-1, ИЛ-2, ФНО, лимфои цитокинов). /2300к/ Кожные пробы : (клеточные реакции) Экстракты аллогенных тканей в качестве антигенов малопригодны, так как они могут стимулировать лимфоциты в результате гистонесовместимости. К некоторым из них может наблюдаться сенсибилизация (после переливания крови и пр.). Чтобы контролировать активность лимфоцитов на аллоАГ контрольные АГ должны быть приготовлены из другой ткани того же индивидуума. Если сенсибилизации к тому АГ нет, а к опытному АГ есть, то только тогда можно делать заключение о ее тканевой специфичности. /2300к/ ГНТ 2-го типа осложняется ГЗТ. Лабораторная диагностика (см. отд-е формы) - Определение антител, связанных с клетками Температурные реакции - Кожные неспецифические (холодовые, тепловые) пробы. 1) Протеины теплового шока (' _тепловая аллергия .') Протеины теплового шока (ПТШ) локализуются внутриклеточно и на клеточной поверхности. В частности, иммунную роль играет пептид 180-188 (ПТШ65), индуцирующий Т-клеточный ответ, коррелировавший с тяжестью заболевания. /2289к/96/ Иммунизация ПТШ65 может защитить мышь от индукции адъювантного артрита. В артритных тканях мышей обнаружены пептиды ПТШ60 и ПТШ70, в крови - Т-клетки и антитела к ПТШ65. Ragno постулировал существование механизма молекулярной мимикрии для инициации и пролонгации артрита. /2289к/ ПТШ60 обнаруживаются на макрофагах, активированных гамма-ИФ и альфа-ФНО. /2289к/ Кожная проба : Пробирку с горячей водой (40-42 о С) помещают на 10 минут на кожу внутренней поверхности предплечья. При положительной реакции через 15-20 минут наблюдается гиперемия, отек, волдырь. /2300к/ 2) ' _Холодовая аллергия .' Кожная проба : кусочек льда помещают на предплечье и через 10-20 минут на этом месте появляются волдыри при непереносимости холода. /2300к/ Аутоиммунное заболевание щитовидной железы _1) Тиреоидит Хашимото.

Лабораторная диагностика - HLA B8 и DRS. /2300к/ - Аутоантитела против АГ к тиреоглобулину (РСК,ИФА,РПГА,РП, РИМ, латексный метод). /2300к/ - АТ против микросомных АГ и 'второго коллоидного АГ' (используют непрямую иммунофлуоренценцию на срезах щитовидной железы./2300к/ - АТ против основного белка микротрубочек - тубулина. /2300к/ - АТ против поверхности клеток эпителия. /2300к/ - Подавление тироксином миграции лимфоцитов. /2300к/ - Цитотоксическое действие лимфоцитов на различные клетки, покрытые АГ-ом железы /2300к/ (Тк=4 тип ГЗТ-?). - Повышено количество Тх2 типа с рецептором к ИЛ-2 в кровотоке. /2300к/ - Cоотношение Тх к Тs (CD4/CD8) повышено незначительно. /2300к/ _2) Тиреотоксикоз. - АТ, стимулирующие гиперплазию эпителия. - Стимулятор щитовидной железы (LATS). - АТ, стимулирующие накопление в щитовидной железе коллоида и цАМФ. - АТ, ингибирующие связывание тиреотропина с рецепторами клеток - Снижение числа CD8-лимфоцитов и повышение соотношения Тх к Тs (CD4/CD8). /2300к/ _Сахарный диабет Инсулинзависимый сахарный диабет - аутоиммунное заболевание; аутоиммунная реакция приводит к разрушению инсулино-продуцирующих клеток.

Больные имеют высокий риск развития других аутоиммунных заболеваний. Часто развивается поражение щитовидной железы - аутоиммунный тиреоидит или болезнь Грейвса. /2239к/95/ _1) Первый тип (инсулин-зависимый) Приобретая DR-АГ, бета-клетки становятся АПК (АГ-презентирующими клетками), запускающими ИО. Появление DR-АГ на бета-клетках под влиянием ИФ, индуцируемого некоторыми вирусами или/и стимуляция ими синтеза макрофагами ИЛ-1 и ФНО, повреждающих бета-клетки. /2300к/ Особую проблему представляет сенсибилизация больных к инсулину животного происхождения (Ig G и Ig A). _2) 2-ой тип АТ к рецептору для инсулина /?/ Лабораторная диагностика: - Генетическая предрасположенность (HLA DR 3/4, и особенно HLA DQ, А1 и HLA DQ, В1. /2300к/ _Рассеянный склероз - Ассоциирован с АГ HLA A3, B7, DR2. /2300к/ - Повышено содержание Ig в спинномозговой жидкости (СМЖ), _ АТ _ против белка миелина . СМЖ и крови. - Общее количество Т-лимфоцитов не меняется или снижено. - Повышено количество В-лимфоцитов. - Повышен уровень Тх (CD4+-лимфоцитов), ИЛ-2 - Снижено количество Тs, на которых в 3 раза повышено число бета-адренорецепторов. - На моноцитах снижена экспрессия DR-АГ. - В СМЖ обнаруживаются МИФ (миграции-ингибирующий фактор), ФНО, гамма-ИФ. /2300к/ _Миастения гравис - АТ против АХ-ых рецепторов и АХЭ (ацетилхолинэстеразы) - 90% больных. /2300к/ - АТ против АГ скелетных мышщ. - Имеется связь между АГ мышечной ткани и АГ вилочковой железы (тимуса). Тимэктомия приводит к клиническому улучшению состояния больных /2300к/ - у 30%-?. АТ могут интенсивно взаимодействовать с комплексом тимопоэтин-АХ-ый рецептор (тимопоэтин снижает нервно-мышечную передачу импульсов). /2300к-с.136/ - Уровень Т-клеток нормальный, но снижается после тимэктомии, хотя состояние больных улучшается. - Супрессорная активность клеток умеренно уменьшена. - Увеличена субпопуляция Т-клеток, имеющих СR1/?/-рецепторы. - Снижена цитотоксическая активность ФГА (фитогемагглютинин)-активированных Т-клеток. /2300к/ Шизофрения - аутоиммунная форма Антифосфолипидный синдром (АФС) (Синдром ПФА - противофосфолипидных антител) Компоненты Патогенное действие Лабораторные гемостаза антифосфолипидных антител проявления СосудистоВзаимодействие с мембраной тромбоцитов Тромбоцитотромбоци- --- повышение адгезии к ЭК --- подавпения тарный ление выработки простациклина --- АТ КоагуляциТорможение образования протромбинового Повышение онный комплекса (фактора V+X+Ca+ФЛ), блокада протромбиногемостаз действия на протромбин вого времени Повышение способности тромбина катализировать образование свертка крови ПротивоСнижение синтеза эндотелием тромбомосвертываюдулина --- снижение активности белка С щая систеПодавление активности АТ-III. Снижение АТма III ФибринолиИнгибиция образования прекалликреина.

Замедление тическая Нарушение клиренса фибрина (активная лизиса эуглосистема фаза фактора ХII + калликреин + ВМК). булинов Снижение выделения активатора плазминогена. _Лабораторная диагностика: - наличие антител к фосфолипидам /3609/ --- эффект антикоагулянта (блокада образования протромбиназы). /3609/86/ - АТ типа волчаночного увеличивают время рекальцификации в присутствии различных видов фосфолипидов. /8000/87/ - удлинение протромбинового времени /3615/82/, - удлинение активированного (каолином) частичного тромбопластинового времени. /8001/89/ - снижение уровня белка S, снижение белка С /7999/ Фибринолитическая активность снижается. /3615/82/ Тормозится Хагеман-зависимый фибринолиз (Табл. 1) /определение каолин-зависимого фибринолиза по Ogston /3615-11/. /3615/82/ Таблица 1. Плазма Время лизиса (мин.) Нормальный уровень 7-14 минут Врожденный дефицит прекалликреина более 120 минут Врожденный дефицит фактора ХII более 120 минут Больные СКВ 25, 75, 15 минут Снижается уровень активатора плазминогена эндотелиальных клеток. /3615/82/ _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ III ТИПА Лабораторная диагностика - Реакции лизиса и повреждения лейкоцитов - Определение ЦИК (повышенный уровень) - Снижение уровня комплемента /с/ - Повышение титра АТ /с/ - повышение СРБ /с/ - ПОЛ /с/ Определение ЦИК (циркулирующих иммунных комплексов) _Значение теста .. Содержание ИК помогает в оценке и мониторинге активности болезни при таких состояниях, как РА, СКВ. Определение АГ-специфических ИК может оказаться полезным при обстоятельствах, когда свободные АТ в сыворотке не выявляются. /1575к/90/ _Варианты методик 1) Биологический тест - Тест угнетения ЕА-розеткообразования (FcR) лимфоцитов больных под влиянием 10-20% аутологичной сыворотки (контроль сыворотки доноров). Причем, данный тест более чувствителен, чем другие методы. - Реакция коагглютинации (агглютинация стафилококков сывороткой больных. /с/ - Агглютинация эритроцитов, покрытых белком А (FcR) золотистого стафилококка. /2300к/ - ЦИК выявляют с помощью клеток (тромбоцитов, клеток Райи), имеющих Fc-рецепторы, которые связывают агрегированные Ig. ЦИК угнетает связывание с FcR частиц, например, эритроцитов, покрытых агрегированных иммуноглобулинами или АТ-ми. /2300к/ 2) С1q-cвязывающий тест ИК= АГ+АТ АТ=Fab+Fc Fc + C1q, иммобилизованный на носителе (колонке с сефарозой). Пропускают сыворотку больного через колонку, промывают, срывают (высокомолярным, 'кислым' /рН 3/ и пр. раствором) лиганд и измеряют элюат спектрофотометрически.

Недостаток: ЦИК кровотока, связанные с С1q, не сядут на колонку. 3) _Осадочные реакции . (желательно с последующим определением в осадке содержания антител /посадкой на колонку с C1q/). Недостаток: в осадок выпадают все крупные комплексы плазмы (обрывки мембран, фибрина, СРБ-лиганд, фибронектин-лиганд и пр.). /с/ а) Водно-кислотные методы. - Сыворотка смешивается с 10% ТХУ (трихлоруксусной кислотой) в соотношении 1:0,5. Надосадок после центрифугирования измеряется на спектрофотометре при длине волны 254нм.

Экстинция менее 0,24 ед. считается нормой. 10% ТХУ определяет (в конечной концентрации 3,3%) осаждает белки с М. более 100 кД. - Осаждение 'ЦИК' дистиллированной водой, подкисленной о,1М раствором уксусной кислоты (рН 4,6). К 0,1 мл инактивированной сыворотки добавляют 2 мл охлажденной до 4оС воды, перемешивают и центрифугируют 30 минут при 3000 об./мин. (при 4оС). Осадок промывают подкисленной водой, растворяют в 3 мл 0,1Н NaOH и измеряют количество белка при 280нм, т.е. количество ЦИК. /2300к/ б) Осаждение ПЭГ (полиэтиленгликолем) ПЭГ добавляется в определенное количество сыворотки, образуется осадок, который растворяют в физрастворе и спектрофотометрируют. 3% ПЭГ - Норма - 23-124 (показания СФ) 4% ПЭГ - Норма - 90-148 [4) Конглютининовый тест] 5) АГ-специфические методы (после выделения специфических ЦИК) базируются на выявлении АГ-ов или АТ после диссоциации ЦИК при рН 2,8-3,2 или путем обработки раствором мочевины, цистеина и других веществ. /2300к-с.234/ Коллагенозы - иммунная патология диффузных заболевания соединительных тканей.

Возможен врожденный волчаночный синдром (+ АТ к ДНК, + врожденный порок сердца). Характерен дефицит С2. _ Патогенез В норме антинуклеарные, антицитоплазматические и антимитохондриальные антитела выявляются в высоком титре (> 1:160) у 1% здоровых обследованных (уровень существенно повышается с возрастом). /2258к/ Антисыворотки против нуклеарных АГ: - WHO 66/233, WHO 4/80. - Стандарты АГ - AF#CDC ANA No1; AF/CDC No 3, N 4, N 8. _ Клиническая картина Клиническая картина СКВ характеризуется полиморфизмом.

Должно быть не менее 4 признаков. 1. Недеформирующий артрит (80-90% больных). 2. Наличие LE-клеток (70-90%). 3. Цилиндроурия (15-50%), плеврит или перикардит (50-70%), 4. Алопеция (облысение) - (40-70%) 5. Эритема лица в форме бабочки (40% больных) 6. Синдром Рейно (20-40%) 7. Повышенная чувствительность к УФ лучам (30-40%). 8. Дискоидная волчанка (20-30%) 9. Изъязвление в полости рта или носоглотки (15-40% больных). 10. Выраженная протеинурия (более 4 г/л), 15-30% больных. 11. Психозы или судорожные припадки (10-20% больных). 12. Гемолитическая анемия (15%), 13. Лейкопения (ниже 4х109л-1) /40% больных/ или тромбоцитопения (ниже 100 х109 л-1 (10% больных), лимфопения. 14. Положительная реакция Вассермана в течение 6 месяцев (АТ к кардиолипину). _ Лабораторная диагностика - снижение уровня Т-лимфоцитов, преимущественное угнетение Тs; - снижение ИЛ-1 макрофагами и моноцитами, ИЛ-2 - уменьшение нормальной концентрации в сыворотке крови С4 и С2 компонентов комплемента - поликлональная активация В-системы - повышение уровня АТ Ig G1, G3. - АТ к ДНК и АТ 2-го порядка (АТ к АТ) - наличие АТ против определенных субпопуляций лимфоцитов - связь с HLA гаплотипом А2, B7, В8, D3, или с гаплотипом А11, B7, В35, DR2, DR3; рекомендуется обследовать родственников больного для выявления ранних форм заболевания. /2300к/ Склеродермия - Нарушение функции фибробластов (несовершенный коллаген) - Антиядерные АТ (80% больных) - антифосфолипидные АТ, - АТ к Scl (70%) - АТ к РНК-полимеразам, топоизомеразе ядер - ревматоидный фактор (РФ) - антитела класса Ig M к Fc-фрагменту Ig G и Ig Е. /2300к/ - АТ против центромеры - лимфоцитотоксины - гипер-гамма-глобулинемия, - ЦИК - снижение уровня Т-лимфоцитов. /2300к/ Синдром Шегрена Шегрен в 1933г. описал синдром, состоящий из трех основных симптомов: 1. сухого кератоконъюнктивита, sicca-синдром (ксерофтальмия-?) 2. ксеростомии, 3. ревматоидного артрита.

Ревматическое поражение начинается раньше, к нему присоединяется поражение слюнных желез. /1407к/ + синуситы, + сухость кожи, + анацидность, + цистит, пиелит, + анемия, СКВ, макроглобулинемия, полимиозит, склеродермия, васкулит, узелковый периартериит, иммунный тиреоидит, иммунный гемолиз и прочие аутоиммунные болезни. /1407к/ Болезнь характеризуется разрушением железистого эпителия во всем организме. /1407к/ _ Этиология Аутоиммунный процесс.

Органоспецифические аутоантитела против - щитовидной железы, - слизистой желудка, - мышц, - ревматоидный фактор (Ig G против Ig M), - противоядерный фактор. /1407к/ _ Патогенез В слюнных железах лимфоцитарная инфильтрация, в первую очередь вокруг полосатых протоков. В эпителии протоков наблюдается пролиферация лимфоцитов, эпителий ацинусов погибает (остаются островки пролиферирующего эпителия). = доброкачественное лимфоэпителиальное поражение. Может переходить в злокачественную лимфосаркому. /1407к/ - Лейкопения - РФ (70-90%) - антиядерные АТ (50-70% больных) - АТ к АГ слюнных желез - снижение Т-клеток и соотношения CD4/CD8=Тх/Тs (норма 1,5-2,5). /2300к/ _ Клиника - Набухание слюнных желез, - сухость во рту (в тяжелых случаях у больного полностью отсутствует слюна). В таком случае затруднено глотание. - По всему телу прощупываются ЛУ, ревматические узлы. - Депрессия. /1407к/ _ Лечение - кортикостероиды, ударные дозы преднизолона, - витамин В12 - психои физиотерапия. /1407к/ Узелковый периартериит _ Лабораторная диагностика - Лейкоцитоз - Гипо-гамма-глобулинемия - Антинуклеарные АТ - РФ - АТ против кардиолипина - HBs-АГ или его АТ (30% больных). /2300к/ Ревматоидный артрит ИК --- активация комплемента.

Ревматоидные узелки состоят из фибрина, лимфоцитов, макрофагов. _ Лабораторная диагностика - РФ = аутоАТ (класса Ig M) к Fc-фрагменту Ig - ревматоидный фактор (выявляются у 70-90% больных). - Увеличение СОЭ - Повышение СРБ - Повышение альфа-2-глобулинов, а затем и гамма-глобулинов. - Анемия - Умеренный лейкоцитоз - Генетическая связь с HLA А11, DR4, DR53, DQ4. - Наличие муциновых преципитатов в синовиальной жидкости. /2300к/ - Уменьшение количества лимфоцитов. /2300к/ - Повышается уровень бета-2-макроглобулина в крови в 2-5 раз. /2300к/ _ВЫЯВЛЕНИЕ ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ IV ТИПА Лабораторная диагностика - Анализ крови и подсчет лимфоцитов.

Категории работ

Биотехнология, биопрепараты (вакцины, сывортки, прививки и т.д.)