Факторы неспецефической защиты - продолжение: Эндоцитоз, экзоцитоз, фагоцитоз, фагоцитарная активность

Исторический аспект Явление фагоцитоза открыл И.И.Мечников в 1893г., наблюдая как клеточные личинки морской звезды поглощают краску), за что ему в начале века была присуждена Нобелевская премия.

Только что введеннные в кровь бактерии моментально исчезали из нее. /293/ До 1969г. фагоцитирующие клетки включали в т.н. ретикуло-эндотелиальную систему, а в 1969г. R.van Furth и соавт. предложили термин 'система мононуклеарных фагоцитов' (СМФ). Гистологический аспект Система мононуклеарных фагоцитов (СМФ) включает: - клетки Купфера печени, альвеолярные макрофаги, гистиоциты соединительной ткани, клетки микроглии цнс, остеокласты, макрофаги лимфатических узлов, селезенки. 85-95% фагоцитирующих клеток организма сосредоточено в печени и селезенке. СМФ делится на 1. внутрисосудистую (гистиоциты селезеночной пульпы, костного мозга и лимфатических синусов) и 2. тканевую.

Последняя в нормальных условиях состоит из покоящихся клеток (длительность жизни от 20 до 60 дней), становящихся активированными гистиоцитами в случаях агрессии. /5987/86/ Активация СМФ происходит под действием ряда бактериальных продуктов, токсинов, иммунных комплексов, стимулированных Т-лимфоцитов, лимфокинов. И.И.Мечников подразделил фагоциты на микрофаги (гранулоциты) и макрофаги. 1. Микрофаги имеют запас гликогена, поэтому обеспечивают основную защиту в анаэробных условиях (в очагах гнойного воспаления при острых инфекциях). Снижение числа нейтрофилов ниже 25% от нормы опасно для жизни. /2269к/ Фагоцитоз у макрофагов /моноцитов/ протекает медленнее, чем у ПМЛ, но бактерицидная активность выше, чем у ПМЛ. /7073/ 2. Макрофаги делятся на подвижные и оседлые. а) Подвижные, циркулирующие макрофаги (моноциты крови, гистиоциты, полибласты) осуществляют хемотаксис.

Присутствуют в селезенке, ЛУ перитонеальной полости. Имеют пероксидазную активность в лизосомах.

Являются Iа + -клетками, т.е. АПК. /81-12-53-135/ б) оседлые (кпд >>>: если лейкоциты прикрепляются к волокнистым структурам, то фагоцитоз идет намного эффективнее). Оседлые сосредоточены в синусоидах печени и некоторых других органов, в тканях, серозных полостях, в легких. Имеют С3-рецепторы.

Содержат пероксидазу в ЭПС. Не способны представлять антиген лимфоцитам. /81-12-53-135/ _3 типа гранул .: 1. МПХ, лизоцим, катионные белки.

Содержимое гранул первой группы стимулирует 'окислительный взрыв'. /1365к/94/ 2. Лактоферрин, лизоцим. (Лактоферрин и катионые белки в макрофагах не обнаружены; в них меньше МПХ). /307/ Второй тип гранул включает ферменты типа катионных белков, протеаз, лактоферрина и фосфолипады А2. /1365к/94/ 3. кислые гидролазы.

Макрофаги имеют 2 типа гранул: специфические (цитохромы, пероксидаза, гиалуронидаза, нейтральные протеазы, активатор плазминогена, эластаза, коллагеназа) и азурофильные. При дефиците специфических гранул нейтрофилов воспалительная реактивность снижается, развиваются тяжелые рецидивирующие бактериальные инфекции. /7073/ Бета-2-микроглобулин в нейтрофилах (65% находится в специфических гранулах, 20% - в секреторных везикулах). /2361к/94/ Дефензины - пептиды, богатые аргинином и цистеином с М. около 4 кД. Обладают широким спектром активности, в т.ч. модулируют взаимодействие нейроэндокринной и иммунной систем.

Оказывают стресс-протективное действие. /2287к/ Показателем защитной функции ПМЛ является уровень щелочной фосфатазы (при воспалительных процессах он возрастает). /7073/ ФУНКЦИИ ФАГОЦИТОВ 1. фагоцитарная (удаление из организма отмирающих или мертвых клеток; их фрагментов; агрегатов белков; частичек пыли и пр.), 2. синтетическая (фагоциты синтезируют компоненты комплемента, интерлейкины, интерферон и др. БАВ), 3. антигенпрезентирующая (макрофаги/моноциты). 4. участие в воспалительных реакциях.

Биохимический аспект Факторы, участвующие в деструкции фагоцитированного материала Кислород-зависимый механизм Кислород-независимый механизм МПХ (миелопероксидаза) Лизоцим О 2 - (супероксид анион) Лактоферрин 0Н - (гидроксильный радикал) Катионные белки 1 0 2 (синглетный кислород) Нейтральные протеазы Н 2 О 2 (перекись водорода) Кислые протеазы Дефензины /2287к/ NO оксид азота /?/ Кислая фосфатаза, липаза, эластаза, бета-глюкуронидаза и катепсины важны в переработке антигена для взаимодействия с молекулами HLA класса II. Обычно именно по ним идентифицируют лизосомы.

Макрофаги имеют обширную сеть митохондрий и шероховатой ЭПС, поэтому в основном 'работают' в аэробных условиях в борьбе с внутриклеточными микробами (спирохетами, грибами, туберкулезной палочкой). [Часто происходит организация мононуклеаров в гранулемы.] Макрофаги делятся на Ia + (мышей) - участвующие в иммунном ответе, и Ia - , фагоцитирующие через Fc-, С3в и др. рецепторы. _Регуляция фагоцитоза СТИМУЛИРУЮТ ИНГИБИРУЮТ Интерферон ТФР-бета (тромбоцитов ...) Лейкоцитарная масса ЛПС грамотрицательных микробов Аминогликозиды ( (перекрестная стимуляция ЛПС Тетрациклины /7506/ и др. продуктами микробов) Экзотоксины бактерий СРБ Некоторые эндотоксины бактерий Пептидогликаны Цитохалазин В ЕКК /2277к/ Конконавалин А Т-лимфоциты /2277к/ Гидрокортизон (подавляет хеЛимфокины сенсибилизированных мотаксис;стабилизирует мемблимфоцитов рану) ФГА Преднизолон (-'-) Тафтсин Спленэктомия Опиатные пептиды (хемотакТиазиды сические агенты) /7518/ Индометацин (аспирин не влиВещество Р яет) на образование О 2 - Аскорбиновая кислота (вит. С) /21Э118-82/ Никотиновая кислота аминофиллин Рифампицин /7506/ Pg E1 Ретиноиды (синтетические аналохолерный токсин ги витамина А) Антимакрофагальная сыворотка Секрет слюнных желез пиявок Торотраст /2399к/ рентгеновское облучение Пептиды рога сайгака (сайги) коллоидное золото (миокристин) Химически индуцированный канцерогенез Клетки могут поглощать значительную часть своей плазматической мембраны (до 50% поверхности в час.). /1559к/84/ Самым сильным, специализированным индуктором макрофагальной активации является гамма-ИФ. Он может индуцировать экспрессию более 100 различных генов в геноме макрофагов. /2461к/95/ ИЛ-4 и ИЛ-13 повышают экспрессию макрофагальных маннозных рецепторов - ММR - маркеров 'альтернативной' активации макрофагов). Up-регуляция MMR под влиянием ИЛ-4, ИЛ-13 и Pg E может быть необходима для вновь рекрутированных моноцитов/макрофагов, обеспечивающих неспецифический клиренс. /2461к/ Гамма-ИФ и ФНО-альфа, вызывающие 'классическую' активацию макрофагов, снижают количество ММР (down-регуляция) на фоне повышения бактерицидности, цитотоксичности и проявления других признаков усиленной функциональной активности клеток.

Возможно, ИФ и ФНО таким образом переключают активированные макрофаги на более эффективный фагоцитоз через FcR и СR1 или на внеклеточную микробицидность, связанную с секрецией супероксидных радикалов в микроокружение. /2461к/95/ ТФР-бета,ИЛ-2, Т-лимфоциты ИФ-гамма,ИЛ-6, ГМ-КСФ, ф -ФНО, b -ФНО В-лимфоциты - ' - /?/ альфа-ИФ,гамма-ИФ ЕКК ИЛ-1,ФНО-альфа, ГМ-КСФ ТФРb Моноциты ИЛ-1,6,8, Г-КСФ,ГМ-КСФ, ф -ФНО, ф ИФ ИЛ-1,8, Бактерии,грибки,простейшие Нейтрофилы ФАТ,ФНОф ГМ-КСФ ТФР-бета, ТФР-бета Фибробласты ИЛ-6,8,ИФ-бета Г-КСФ,ГМ-КСФ Другие ИЛ-6,ИЛ-8, клетки Эндот.клетки Г-КСФ,ГМ-КСФ Тромбоциты ИЛ-1,8 Схема цитокиновой регуляции антимикробной активности нейтрофилов. /2343к/94/ _Фенотипы - Гамма-ИФ вызывает приобретение макрофагами 'воспалительного' фенотипа. - Противоположный воспалительному фенотип - с пониженной экспрессией генов провоспалительных цитокинов (ИЛ-1, ФНО-альфа, МСР-1), пониженной цитотоксичностью, усиленной продукцией ИЛ-6. Такой фенотип могут вызвать катехоламины (через альфаи бета-адренергические рецепторы), вызывающие повышение уровня внутриклеточного цАМФ. /2461к/ - Под влиянием ИЛ-4, ИЛ-13, Pg E макрофаг приобретает 'асимметричный' фенотип с избирательной активацией 'scavenger' рецепторов типа ММR. /2461к/ - В затухающем очаге воспаления (в присутствии ИЛ-6) формируется иной фенотип. /2461к/ Подавление фагоцитоза может привести к инфекционным заболеваниям, паразитарным инвазиям, злокачественным новообразованиям (тумороцидный эффект макрофагов - ПОЛ), гемобластозам.

Активированные нейтрофилы выделяют ИЛ-1. /2277к/ _ Дефекты фагоцитоза Снижение фагоцитарной активности может быть обусловлено следующими дефектами. 1. Дефект подвижности (хемотаксиса) фагоцитов (синдром 'ленивых лейкоцитов') - рецидивирующие или хронические бактериальные инфекции кожи, пазух, легких, среднего уха, десен. /7514/ Дефект связывания актина.

Развивается при недоедании.

Лейкоциты в меньшей степени накапливаются в кожных окнах. /7685/82/ 2. Дефект поглощения частиц (острый лейкоз, апластическая анемия). Дефект фагоцитоза может быть после лечения стероидами. /7685/82/ 3. Дефект образования гранул и дегрануляции , причем возможен дефект образования - азурофильных гранул (первичный дефицит МПХ /см. ниже/, миеломоноцитарный лейкоз, миелобластный лейкоз, острый миелолейкоз), - специфических гранул (сочетается с нарушением хемотаксиса и противомикробной активности нейтрофилов), - а также тех и других - синдром Чедиака-Хигаши (неспособность к формированию нормальных фаголизосом; летальный исход в детском возрасте); /313/ 4. Дефект внутриклеточного метаболизма (облучение, хронический гранулематоз, ревматоидный артрит, фиброз легких). /7476/83/ Фагоциты поглощают микробы, но не убивают их. /7073/ а) _Хроническая гранулематозная болезнь . (ХГБ; нарушение продукции метаболитов кислорода) - первичное ИД-ое состояние, возникающее из-за отсутствия или дисфункции НАДФ-оксидазы в фагоцитах. В итоге не запускается кислородный взрыв, не образуется перекись водорода. Для больных характерен отрицательный NST-тест (с нитросиним тетразолием). Различают 2 варианта семейной передачи болезни: Х-сцепленный (болеют мальчики) и аутосомно-рецессивный /2225к/95/ - отсутствие цитохрома 'b' в нейтрофилах.

Приводит к незавершенности фагоцитоза. /7073/ Идентифицировано несколько мембранных и цитозольных компонентов НАДФ-оксидазы (клонировано соответственно нескольк ДНК-последовательностей). Мембранные - цитохром b558 (состоящий из пептидов gp91-фокс и р22), в цитоплазме - полипептиды р47-фокс и р67-фокс (название компонентов 'фокс' = phox от Phagocyte oxydase). В процессе активации клетки оба протеина перемещаются в мембрану, где вместе с цитохромом b558 образуют функциональную оксидазу. /2225к/95/ - От 60 до 70% всех случаев болезни - Х-сцепленный вариант (кодирующий ген в половой хромосоме), связанный с дефицитом gp91-фокс; - менее 55% всех случаев - дефект р22-фокс (кодирующий ген - в 16 хромосоме и поэтому заболевание передается аутосомно-рецессивным путем). /2225к/95/ - Дефекты р47-фокс ответственны за 20% случаев ХГБ (кодирующий ген расположен в 7 хромосоме; заболевание передается аутосомно-рецессивным путем). /2225к/95/ - Дефекты р67 ответственны за 5% ХГБ (белок кодируется в 1 хромосоме; передача аутосомно-рецессивным путем). /2225к/95/ Заболевание характеризуется: -падением продукции перекиси водорода в фагосомах, - у мальчиков отсутствует НАДи НАДФ-оксидаза, - у девочек отсутствует ГПХ (есть часть заболевших среди девочек); /7685/ Хирургическое лечение + антибиотики позволяют выжить до 20-30 лет. /7685/ При хроническом гранулематозе наиболее частое инфицирование аспергиллами. /7685/82/ Поскольку в фагоцитах микробы защищены от антибиотиков, заболевание сопровождается хроническими бактериальными инфекциями (в частности, стафилококковыми), воспалением различных органов и тканей, септическими осложнениями.

Осложнения в виде абсцессов легких, печени, брюшной полости. (Сепсиса, абсцессов мозга и менингита почти не бывает-?). /7514,7524/ Одна треть (1/3) больных погибает до 7 лет.

Поэтому заболевание называется гранулематозом детского возраста (синдром Джоба) . /313/ б) Недостаточность миелопероксидазы (МПХ). При недостаточности МПХ больные восприимчивы - к кандидам и - стафилококковой инфекции (лечение антибиотиками). /7685/82/ - клебсиеллам - кишечной палочке, - серрациям, - сальмонеллам - микобактериям, - аспергиллам - псевдомонас и др., имеющим каталазу. /2225к/ 5. Дефект опсонизации - низкий уровень комплемента или антител.

Наблюдается при миеломе, агаммаглобулинемии, поражениях печени. У таких больных отмечаются повторные респираторные инфекции, обусловленные инкапсулированными пневмококками или Haemophilus influenzae. /7514/ 6. Лейкопения . Нейтрофилия в крови развивается при первичных иммунодефицитах, синдроме Костманна, хронической идиопатической нейтропении, синдроме Швахмана, сепсисе, тимоме, наличии антител к нейтрофилам, нарушении функции Т-супрессоров, гемодиализе. /7476/ 7. Нарушения в функции или количестве лейкоцитов, вызванные лекарствами ( стероидами, антибиотиками ). _Усиленная фагоцитарная функция .. Игольчатый укол или незначительная травма без инфицирования могут привести к нагноению или гнойному артриту.

Клиническая картина у таких больных может имитировать таковую при подавленной фагоцитарной функции, однако микробиологические исследования будут отрицательными. /7514/87/ _ Фагоциты участвуют в развитии воспалительной реакции .. Нейтрофилы секретируют факторы, индуцирующие апоптоз разных клеток-мишеней ( _ апоцитоз . окружающих клеток). В свои вакуоли нейтрофилы выделяют фактор, индуцирующие апоптоз (ФИА) клеток, которые разрушают геном микрообв. Это ферменты с высокой нуклеазной активностью ( _нуклеазы .). При массивном проникновении в организм инфекционных агентов нейтрофилы активно поглощают микробы и, не заботясь об их истинном переваривании, выбрасывают в межклеточное пространство значительные количества ФИА. Цель реакции - произвести в сжатые сроки как можно более выраженное _ повреждение генетического аппарата микробов .. ФИА губительны для всех клеток: они способны осуществить деградацию НК генома любых биосистем - эукариотов, прокариотов, вирусов.

Нейтрофильные ФИА индуцируют ускорение апоптоза и у самих нейтрофилов. /2226к/97/ Фагоцитоз и апоцитоз - разные, но фиункционально сопряженные процессы.

Нейтрофилы с помощью ФИА инициируют воспалительную реакцию.

Процесс воспаления - это реакция организма на ФИА. /2226к/97/ Нейтрофилы - это клетки, у которых включена генетически заданная программа клеточной гибели. На поверхности нейтрофилов по прошествии некоторого времени появляются стркутуры, которые обусловлены апоптозом и которые узнаются макрофагами (САН - структуры апоптоза нейтрофилов). Фагоцитоз 'старых' нейтрофилов осуществляется макрофагами. /2226к/97/ - ПОВТОР Физиологический аспект Этапы фагоцитоза: 1. Хемотаксис, 2. Узнавание (адгезия - прилипание частиц к поверхности фагоцита), 3. Поглощение, 3а.Слияние фагосомы с лизосомами, 4. Переваривание. 5. Удаление 'отходов'. /307/ Первым необходимым условием для осуществления фагоцитоза является накопление макрофагов в местах присутствия антигена или продуктов тканевого распада.

Хемотаксис (приближение или аттракция; для подвижных фагоцитов) - направленное движение клетки по или против химического градиента. [Ориентация на определенные сигналы - хемотаксис; миграция - хемокинез.] Хемотаксис может быть положительным (к хемоаттрактанту) и отрицательным ('от себя'). /307/ _Хемотаксические факторы . /7519/ - С5а, С5а-dearg фрагменты комплемента (для нейтрофилов); При дефиците С5а ингибируется инфильтрация нейтрофилов в очаг воспаления.

Вирулентные стрептококки группы А синтезируют ингибитор С5а. /7508/ Пептидные ингибиторы С5а используются для подавления воспалительного ответа. /7511/ - калликреин (переводящий С5 в С5а) /7330/87/ - С3а /2291к/ - ЛТ В4; - формил-метионил-лейцил-фенилалан, - ФАТ /2291к,2369к/ - ИЛ-8 - ФНО-альфа - фактор переноса (лимфокин); - продукты распада -- соединительной ткани (пептиды коллагена); -- иммуноглобулинов (тафтсин - тетрапептид; воздействие трипсина); -- фибриногена (фибринопептид В) и другие продукты ССК; - факторы хемостаксиса (нейтрофильные, фибробластов, макрофагов - ИЛ-1,лимфоцитов; тучных клеток для эозинофилов); - опиатные пептиды. - формилпептиды St.aureus, E.coli (усиливают экспрессию CD11b/CD18 на поверхности нейтрофилов) 6 адгезия к ЭК 6 проникновение в интерстиций. /2291к/ [0-токсин Cl.perfringens подавляет хемотаксис нейтрофилов, но не макрофагов.] Хемоаттрактанты различного происхождения - усиливают движение, - в 10-20 раз повышают экспрессию рецепторов (нейтрофилов) /2369к/ -- стимулируют экспрессию молекул адгезии /2291к/ -- увеличивают экспрессию рецептора для С3в (СR1). Скорость движения макрофагов - 20 мк в минуту.

Узнавание (адгезия) : 1. Непосредственная адгезия (неопсонизирующее распознавание) проходит по следующим механизмам: а) Взаимодействие по электростатическому _заряду . (поглощение полианионов). Показано, что перитонеальные макрофаги и купферовские клетки имеют поверхностные рецепторы к анионным частицам. /7522/ б) Поглощение _гидрофобных частиц . (если объект более гидрофобен, чем макрофаги). Большинство бактерий имеют гидрофобную природу и легко захватуваются фагоцитами. /307/ Комплемент повышает гидрофобность фагоцитируемых частиц и т.о. усиливает фагоцитоз.

Фагоциты имеют множество участков связывания липида А (ЛПС Гмикробов). (11.53.304-91) в) _Интегрины и селектины . (поверхностные рецепторы). С помощью селектинов осуществляется 'качание' (rolling) фагоцитов на поверхности ЭК перед их твердым приклеплением спомощью интегринов к этой поверхности. /2291к/ Интегрины: три гетеродимера, состоящие из общей бета-цепи (CD18) и трех альфа-цепей (CD11a, CD11в, CD11с). /2291к/ Интегрин В 3 играет главную роль в узнавании апоптотических нейтрофилов. /7964/90/ На фагоцитах 2 вида селектинов: L (CD62L) и E (CD62E). /2291к/ г) Синтез _N-ацетилглюкозаминидазы . и тромбоксантина В 2 (ТХ В 2 ) для фагоцитоза эритроцитов и зимозана (грибов). /7964/ Без опсонинов поглощаются стрептококки, некоторые кишечные палочки, микобактерии. 2. Опсонин-опосредованный фагоцитоз проходит через рецепторы к опсонинам (комплемент-зависимая и др.; антителозависимая, т.е. неспецифическая и специфическая) - веществам, взаимодействие которых со своими рецепторами приводит к фагоцитозу. _Опсонины . /7523/ 1. Ig G1, Ig G3 - взаимодействие через Fc-рецепторы (антителозависимый или специфический фагоцитоз); Ig А,М,Е,D практически лишены опсонизирующей активности. 2. Фрагменты комплемента СR1 - рецептор для С3b, C4b, C5b, С5b67 /?/ CR2 - рецептор для С3d CR3 - рецептор для С3bi C1qR -рецептор для субкомпонента С1q (не встречающегося в свободном виде). Активация СR1 приводит к стимуляции фагоцитарной активности, окислительного метаболизма и высвобождению лизосомальных ферментов. /3032/ Например, через антитела или фрагменты комплемента поглощаются микробы (бактерии семейства кишечных, микоплазмы, стафилококки и др.). 3. С-РБ /7521/, - рецептор-? 4. Фибронектины (рецептор для фибронектина) 5. Фибриноген, фибрин /?/ 6. Рецепторы лектино-подобной природы - С1q и др. (маннозо-, галактозо-связывающие и др.) - поглощают объекты, включающие в свой состав соответствующие углеводные остатки. = _Лектин-зависимый фагоцитоз . /7520/ С1q (мембранный С1q). Рецепторную функцию для Fc-фрагментов иммунных комплексов на макрофагах может выполнять субкомпонент С1q, который перед выделением из клетки включается в мембрану. /3014,3017-255/ На макрофагах обнаружены лектины со специфичностью к галактозе и к N-ацетилгалактозамину; на альвеолярных макрофагах и клетках Купфера - лектины маннозного типа.

Данный лектин связывается помимо маннозы с N-ацетилглюкозамином, глюкозой и фукозой (Гбактерий, микобактерий, дрожжей). /7322/88,7513/ Такое взаимодействие обеспечивает сборку на белке комплексов С1r 2 -C1s 2 и активацию КПК, т.е. С3в-опсонизацию. Белок, связывающий маннозу, подобен С1q-субкомпоненту комплемента: М. 700 кД, состоит из повторяющихся единиц (32кД). Низкий уровень белка, связывающего маннозу, ( мкг/л) связан с повторными инфекциями в возрасте от 6 месяцев до 1,5 лет. /7513/ Имеется маннансвязывающая протеаза, способствующая самоактивации С1r и С1s и таким образом определяющая лектиновый путь активации комплемента. /7234/94/ Маннозо-связывающая сериновая протеаза проявляет С1s-подобную активность и таким образом активирует комплементарный каскад. /1995г./ 7. Рецепторы углеводной природы, взаимодействующие с лектинами чужеродных объектов (микробов и пр.). На поверхности фагоцитов имеются интегральные лектины и структурные карбогидраты (мишень для лектинов бактерий), поэтому связывание происходит двумя путями (Рис. ) Карбогидраты микроорганизмов связываются с лектинами фагоцитов. (При экспериментальном заражении животных двумя штаммами бактерий - несущих и не имеющих поверхностных лектинов, поглощались лишь бактерии, несущие лектин; бактерии, не имеющие лектина, избегали фагоцитоза и пролиферировали в организме хозяина. /7517/) Третья стадия фагоцитоза - поглощение проходит за счет сокращения актомиозиновых нитей; мембрана закрывается как застежка-молния.

Мелкие частицы захватываются при волнобразных перемещениях складок клеточной мембраны. Для поглощения более крупных частиц и клеток (эритроцитов, бактерий) типично обтекающее движение - образование псевдоподий.

Фиксированные макрофаги для фагоцитоза бактерий из кровеносного русла могут 'выдвигать' длинные цитоплазматические отростки между эндотелиальными клетками. Если объект диаметром более 10 мкм, его могут поглощать сразу несколько макрофагов: объект частично дезинтегрируется, фагоцитируется и переваривается по фрагментам. /307/ После 50%-ой утилизации мембраны при фагоцитозе с утратой большинства поверхностных маркеров восстановление ее происходит после лаг-фазы продолжительностью 4-8 часов и требует интенсивного синтеза РНК и белка (фосфолипидов,холестерина)./350/ Образование фаголизосом (слияние с азурофильными гранулами и лизосомами). В аутофагосомах содержатся компоненты самих клеток хозяина (осколки мембран, митохондрии и др.). Четвертая стадия - переваривание . Слияние с лизосомами. _Лизосомы . - гранулы с диаметром 0,25-0,5 мкм, содержащие большой набор ферментов (кислая фосфатаза, бета-глюкуронидаза, МПХ, коллагеназа, фагоцитин, лизоцим, катионные белки /лактоферрин, дефензины и пр./). /307/ В настоящее время особо важное значение придается дефензинам - богатым аргинином белкам, которые обладают способностью встраиваться в липидный слой клетки, нарушать ее проницаемость и убивать широкий спектр бактерий, грибов и даже вирусов. /2291к/ Первыми вливают свое содержимое в фагосому _специфические (или вторичные) _гранулы ., содержащие лизоцим, лактоферрин, белок, связывающих витамин В 12 и пр.

Вторыми - _азурофильные . (или первичные) гранулы, содержащие набор гидролаз, МПХ. /2291к/ Наступает _дыхательный и метаболический взрыв . (в частности, под действием ЛПС Гмикробов). Наблюдается повышенный оборот фосфолипидов и холестерина, 3-кратное увеличение поглощения кислорода и глюкозы, активности НАДФ-оксидазы, усиливается гликолиз, повышается продукция перекиси водорода, активируется гексозомонофосфатный шунт. В результате дыхательного взрыва происходит окисление сульфгидрильных групп мембранных белков до дисульфидов.

Процесс локальной полимеризации продолжается до тех пор, пока поглощаемая частица не будет полностью окружена мембраной. /7527/ Для осуществления движения гранулоциты человека нуждаются в присутствии экзогенной глюкозы, тогда как их фагоцитирующая активность зависит от способности сохранять гликоген. /7532,1831, 1601/ Основным источником АТФ фагоцитов является гликолиз, для альвеолярных макрофагов - окислительное _фосфорилирование .. /1770/ Как и в скелетной мышце, в макрофагах содержится 3-4-кратный молярный избыток креатинфосфата над АТФ. При фагоцитозе снижается содержание креатинфосфата (уровень АТФ не меняется). Биохимические изменения в метаболизме моноцитов во время поглощения: - Увеличение аэробного и анаэробного гликолиза, гликогенолиза, - Повышение потребления кислорода, - Увеличение утилизации глюкозы по гексозо-монофосфатному шунту - Повышенный оборот фосфолипидов и холестерина - Временное увеличение концентрации лизосомальных ферментов - Накопление перекиси водорода - Секреция пирогенов а _) Ферментативная деструкция (кислород-независимый процесс) .. Ведущим механизмом деструкции является синтез активных форм кислорода (супероксиданиона, синглетный килород, перекись водорода, . ОСl, . ОBr, . OJ (галогенизированные формы образуются при участии миелопероксидазы - МПХ). /2689к/ Кислороднезависимые механизмы проходят преимущественно в гнойном очаге. При снижении в лизосомах рН ( поглощения начинают работать бета-галактозидаза, бета-глюкуронидаза, коллагеназа, липаза, эстеразы, лизоцим, кислая щелочная фосфатаза, лактоферрин. В результате все большего присоединения азурофильных гранул рН снижается до 4,5 (средняя рН лизосом - 4,7 - 4,8). Расщеплением убитых микробов начинают заниматься кислые протеазы - катепсины и др. (Насчитывают более 80 кислых гидролаз.) Концентрация ферментов постепенно увеличивается.

Оптимум рН для катепсина А - 5,0, катепсина В - 4,8, катепсина С - 6,0, катепсина Д - 3,2 и 4,5, катепсина Е - 2,5. /7475/83/ б _) Деструкция радикалами (кислород-зависимый процесс); ПОЛ . Поглощение микроба фагоцитом сопровождается окислительным взрывом, в процессе которого _НАДФ-оксидаза . катализирует образование мощных антимикробных агентов путем превращения молекулярного кислорода в О 2 - . Образование других высокоактивных кислородных метаболитов - перекиси водорода и гидроксильного радикала (ОН - ) - происходит без участия ферментов, а образование гипохлоридного аниона (ОСl - ) - при участии _миелопероксидазы (МПХ). /2225к/95/ [Происходит резкая активация гексозомонофосфатного шунта 6 образование НАДФН 6 восстановление молекул кислорода на цитохроме b245. Происходит бурное потребление кислорода. В результате образуется перекись водорода, различные радикалы кислорода, МПХ запускается мощная система галогенирования, что сопровождается гибелью микроорганизмов.

Глюкоза + НАДФ 6 шунт 6 пентофосфат + НАДФН НАДФН + 0 2 6 цит.в245 6 НАДФ + + 0 2 - (надпероксидный анион) Фермент, обеспечивающий образование ключевого окислительного элемента - 0 2 - , представляет собой,по-видимому, мембраносвязанный флавопротеид, использующий в качестве физиологического агента НАДФ. В основе продукции супероксида лежит использование активной формы железа и некоторых других соединений не самого нейтрофила, а клетки-мишени. /7516/ 20 2 - + 2Н + 6 спонтанная дисмутация 6 Н 2 0 2 + 1 0 2 (синглетный кислород) Н 2 0 2 + 0 2 - 6 1 0 2 + ОН - + ОН . (свободный гидроксил) Н 2 0 2 + Сl - 6 МПХ 6 ОСl - + Н 2 0 6 О 2 + Сl - + Н 2 0 20 2 - + 2Н + 6 0 2 + Н 2 0 2 (фермент - надпероксиддисмутаза) Н 2 0 2 6 каталаза 6 2Н 2 0 + 0 2 ] Сами фагоциты защищаются от радикальных форм ферментами - антиокислительной системой (СОД, каталазой, наличием глутатион-восстановительной системы). Содержание пероксидазы снижено при ревматизме, туберкулезе, инфаркте миокарда, опухолевых заболеваниях. /7515/ Ацетилсалициловая кислота (60 мкг/мл) не влияет на потребление кислорода и образование супероксида; индометацин ингибирует потребление кислорода и образование супероксида. /21Э118-82/ Окислительные и другие метаболиты фагоцита по системе микротрубочек поступают внутрь фаголизосомы и обеспечивают бактерицидный и тумороцидный эффект макрофагов. В результате потребления ионов водорода (особенно в условиях гнойного очага воспаления, не снабжающегося кислородом) повышается рН и создаются оптимальные условия для работы катионных белков (катепсина G) и лизоцима.

Катионные белки усиливают генерацию супероксида. /7477/88/ Деструктированные объекты окончательно перевариваются гликолитическими, протеолитическими, липолитическими и прочими ферментами фагоцитов.

Мономерные субъединицы (аминокислоты, моносахара, глицерин, жирные кислоты, нуклеотиды) включаются в общий метаболический процесс организма, чужеродные углеводные и др. субстанции выбрасываются в кровоток и выделяются с мочой, а непереваренные антигенные детерминанты встраиваются в процессе экзоцитоза в наружную мембрану, образуют комплекс с антигенами HLA II класса и запускают иммунный ответ.

Некоторые авторы считают, что фагоцитоз и функцию антигенпредставляющих клеток (АПК) осуществляют разные субпопуляции клеток.

Образуется оксид азота (NO). /2319к/97/ Активизированные нейтрофилы (супернатант) обладают цитотоксическими свойствами в отношении опухолевых и ВПК. Эффект не связан с активными формами кислорода, дегрануляцией, метаболитами АК. /2319к/97/ 3 исхода фагоцитоза : гибель микроба, гибель фагоцита, симбиоз.

Различают завершенный и незавершенный фагоцитоз. При незавершенном фагоцитозе микробы поглощаются, но не погибают и не преревариваются, а иногда размножаются (покидают фагосому и циркулируют в цитоплазме). В случае завершенного фагоцитоза в дальнейшем происходит экзоцитоз (выброс продуктов деградации) или регургитация (выброс неполностью закрытой фагосомы- ?). Механизмом экзоцитоза выбрасываютс из клетки белки, синтезирующиеся на рибосомах ЭПС. Они переходят в цистерны эпс, затем аппарат Гольджи, направляются к поверхности клетки, сливаются с мембраной клетки и содержимое выходит из клетки.

Микробы, которые поглощаются /350/84/ без опсонизации через комплементарные через комплементарные или Fc-рецепторы и Fc-рецепторы шероховатые формы микоплазмы Е.с. капсулированная пневмококков стафилококки с (с капсульным АГ) стрептококки белком А сальмонеллы с Vi-АГ (без гиалурон.к-ты и М-белка) нек.штаммы Е.с., стафилококков, микобактерий, гонококки Эволюционно сформированные механизмы защиты микробов от фагоцитоза : 1) Капсулы пневмококков, сибиреязвенных бацилл, клебсиелл, СГ и др. микробов. К-антигены кишечной палочки, сальмонелл (капсульные АГ). Полисахариды менингококков, возбудителей чумы, микоплазм. Если микробы декапсулировать, то они фагоцитируются. 2) Белок А стафилококка, белок М стрептококков, представляющие функционально белки, подобные Fc-рецепторам (сцепление с антителами происходит не антиген-связывающей областью /Fab-фрагментом/, а эффекторным звеном /Fc-фрагментом/, поэтому антитела неспецифически поглощаются, но не могут выполнить Fc-зависимых функций - проактивировать фагоцитоз или систему комплемента). 3) ЛПС энтеробактерий, воскоподобный слой микобактерий, гиалуроновая кислота стрептококков, бледной трепонемы. 4) Изменение метаболизма фагоцитов - Пероксидаза, каталаза многих микробов (антиоксиданты блокируют ПОЛ в фаголизосомах). При ряде ООИ. - Блокада слияния фагосомы и лизосомами (у ряда микробов). - Индукция тормозных медиаторов - ТФР-бета, ИЛ-10 макрофагами (Lrishmania spp., Trypanosoma cruzi, Mycobacterium avium) /2461к/95/ 6 подавление окислительного и пр. метаболизма, внутриклеточная персистенция. - Дифтерийный токсин и пр. (холерный токсин активирует = адъювант) 6 изменение метаболизма фагоцитов. - Изменение процессов фосфорилирования клеточных белков, активности протеинкиназы С, Са 2+ -зависимого пути передачи сигналов. 5) Пили гонококков препятствуют поглощению микроба.

Зачастую фагоцитоз опсонизированных антителами микробов завершенный, неопсонизированных - незавершенный. . см. материал по практическим занятиям Практические занятия - Определение абсолютного и относительного числа нейтрофилов и моноцитов - Определение фагоцитарной активности нейтрофилов. ОЦЕНКА ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ Фагоцитозом называется поглощение клетками микробов или чужеродных частиц.

Снижение числа нейтрофилов ниже 25% от нормы опасно для жизни. /2269к/ после комплементарного лизиса АПК, КПК АТ Фагоцитоз после 'работы' антител (ИК) уровень АТ комплексов с фибронектином, альфа-2-макроглобулином, С-РБ, лектинами и пр. Для изучения поглощения используют бактериальные клетки (St.aureus или E.coli), дрожжи, латексные частицы. Более интенсивно фагоциты поглощают чистицы, обработанные сывороткой, содержащей опсонины (Ig G, комплемента, фибронектин, СРБ и др.). /2291к/ При определении фагоцитарной активности определяют следующие показатели: - фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих нейтрофилов к общему количеству нейтрофилов; - фагоцитарный индекс - среднее число микробных тел, захваченных каждой клеткой; - опсонический индекс - переваривающая способность - постепенное уменьшение ( в течение 50-60 минут) интенсивности окрашивания фагоцитированных микробов вплоть до их полного обесцвечивания; - завершенность фагоцитоза - отношение лейкоцитов с завершенным фагоцитозом к общему числу лейкоцитов с фагоцитированными микробами, выраженное в процентах. /272-53/ _ Методики . : Фагоцитарную активность можно определять в условиях in vitro и в условиях in vivo. I. In vitro. - Методы оценки экспрессии С3- и Fс-рецепторов по тесту РОК; - Радиометрические методы изучения стадии захвата. - Тест восстановления нитросинего тетразолия. По реакции восстановления нитросинего тетразолия судят об стимуляции гексозомонофосфатного шунта. /1583-4/ II. In vivo. Белым мышам вводят в/бр. 2мл стерильного МПБ, чем вызываютлокальный лейкоцитоз. Через 4 часа в/бр. вводят 1мл 2млрд-ой культуры Staphylococcus albus. Через 10-15 минут из перитонеальной жидкости готовят мазки (можно из осадка после центрифугирования), окрашивают метиленовым синим.

Незавершенный фагоцитоз (наблюдается при поглощении туберкулезных палочек, возбудителей лепры, лейшманиоза, гонореи, менингококков, вирусов, риккетсий) : Рис. 'Незавершенный фагоцитоз гонококков (мазок in vivo)' Показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) - процентное отношение умерщвленных и всех поглощенных микробов (примерно равно 0,80). Выделяют 5 степеней завершенности фагоцитоза (ЗФ): - высокая ЗФ (1,0-0,82); - средняя (0,81-0,45); - слабая (0,44-0,32); - очень слабая (0,31-0,29) - ЗФ отсутствует (0,28-0,25) Фагоцитарная активность (фагоцитоз стафилококка) Реакцию осуществляли по методу Н.В.Васильева и соавт. (1972). Для постановки реакции в лунки иммунологического планшета вносили по 15 мкл гепарина в концентрации 10 ед/мл, 50 мкл цельной крови, взятой с пальца натощак, и добавляли 25 мкл 2 х 10 9 микробных тел/мл суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus разведенных на 0,1 М фосфатном буфере рН 7,2. В опытные лунки вводили по 10 мкл расстворов изучаемых полипептидов, в контрольные - 10 мкл фосфатного буфера.

Лейкоцитарно-микробную взвесь перемешивали и инкубировали при температуре 37С в течение 30 минут, повторно встряхивая каждые 5 минут. После инкубации взвесь ресуспендировали, готовили мазки, фиксировали 10 минут метанолом и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Готовые препараты микроскопировали с использованием масляной иммерсии и вели подсчет в 200 нейтрофилах.

Поглотительную способность фагоцитов оценивали по следующим показателям: 1) фагоцитарный показатель - процент фагоцитировавших клеток из числа сосчитанных нейтрофилов; 2) фагоцитарный индекс - среднее число микробов, поглощенных одним активным нейтрофилом. Для оценки переваривающей функции нейтрофилов определяли показатель завершенности фагоцитоза (ПЗФ) по формуле: общее количество переваренных микробов ПЗФ = х 100 %. общее количество поглощенных микробов Чувствительным методом оценки функциональной активности фагоцитов является метод определения хемилюминесценции крови. /7062/ - Приготовить кровяно-микробную взвесь (0,05мл 2% цитрата натрия, 0,1мл крови и 0,05мл 2 млрд-ой взвеси микробов - микрококков); - для определения опсонического индекса в опытную пробу дополнительно добавляетя антисыворотка к микробам или сыворотка больного для определения функциональной активности антител к микробам; - выдержать в термостате 30 мин. при 37 0 С. - приготовить мазок из кровяно-микробной взвеси; - высушить мазок, окрасить по методу Филлипсон: краситель Романовского развести этиловым спиртом 1:3. На высушенный препарат наносят 5 капель красителя и выдерживают 5 минут (одновременная фиксация и окраска). Не сливая краску, добавляют водопроводную воду, 5 капель на 5 минут.

Промывают водой, высушивают, микроскопируют с иммерсией. - В мазке определяют а) фагоцитарный показатель - процент фагоцитирующих лейкоцитов (среди полиморфоядерных лейкоцитов). Подсчитывают 100 гранулоцитов и, например, если 35 из них водержат микробы, то фагоцитарный индекс равен 35%. б) фагоцитарное число или индекс (количество микроорганизмов, поглощенных одним нейтрофилом); считают суммарное количество микроорганизмов, например, 567 во всех фагоцитирующих гранулоцитах /80/ и делят на число фагоцитов.

Частное от деления (567:80=7) отражает сруднюю поглотительную способность одного фагоцита. в) определяют опсоно-фагоцитарный индекс (ОФИ). Для этого либо рассчитывают частное от деления ФЧ (фагоцитарного числа) больного на ФЧ здорового донора (при этом ОФИ должен быть больше единицы; либо ОФИ определяют эмпирическим методом, с помощью которого анализируют состояние 25 нейтрофилов по следующей схеме: Количество микроОценка фагоцитоза Количество нейтОФИ бов, фагоцитиророфилов с данной ванный одним степенью фагоцигранулоцитом тарной активности 0 0 2 0х2=0 от 1 до 20 + (один) 5 1х5=5 от 20 до 40 ++ (два) 10 2х10=20 от 40 и более +++ (три) 8 3х8+24 Итого: ОФИ=49 Максимальное значение ОФИ - 75, т.е. во всех 25 нейтрофилах фагоцитировано от 40 и более микробов. У здоровых людей ОФИ равен 10. ОФИ от 10 до 24 - слабо положительный (+); от 25 до 49 - ясно выраженная реакция (++); от 50 до 75 - резко положительная реакция (+++). Полученые результаты внести в протокол.

Фагоцитарный показатель у здорового человека - 70-84%. Фагоцитарное число у здорового человека - 4-?. Фагоцитарное число после обработки микробов антителами (иммунной сывороткой) или комплементом - Опсонический индекс - больше 1. Фагоцитоз культуры стафилококка или микрококков в отсутствие антител идет плохо, при наличии антител в сыворотке или плазме фагоцитоз ускоряется, при добавлении комплемента или активации комплемента в крови исследуемого фагоцитоз резко ускоряется, т.к. происходит как через Fc-, так и через С3в-рецепторы.

Оценка степени перекисного и радикального окисления по НСТ-тесту (NBT-тест) Тест восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) Тест бессубстратного восстановления нитросинего тетразолия основан на способности фагоцитов утилизировать кислород с образованием высокореактогенных свободных радикалов. НСТ является индикатором респираторного взрыва.

Сущность метода заключается в образовании нерастворимых окрашенных зерен формазана при восстановлении НСТ супероксидным радикалом. Метод высокоинформативен - для оценки функциональной активности фагоцитов, - прогнозирования тяжести заоблевания, - контроля за эффективностью антибактериального лечения, - дифференциальной диагностики вирусных и бактериальных заболеваний и пр. /2291к/ - Получены доказательства высокого уровня корреляции между образованием активных форм кислорода и киллингом. Метод Н.Е.Виксмана, А.Н.Маянского (1979). Изучаемые образцы веществ в количестве 20 мкл вносили в лунки иммунологического планшета, в контрольные лунки - 20 мкл среды 199. В каждую из лунок вносили по 20 мкл цельной крови, взятой из пальца здоровых людей пипеткой, предварительно промытой раствором гепарина 250 ед/мл и добавляли 20 мкл 0,15% суспензии нитросинего тетразолия (Reanal, Венгрия) на 0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2. Содержимое лунок осторожно перемешивали и инкубировали при температуре 37 о С в течение 30 минут, встряхивая планшеты каждые 10 минут. После инкубации содержимое перемешивали, готовили мазки и высушивали на воздухе.

Готовые мазки фиксировали метанолом 10 минут, высушивали и докрашивали 0,5% раствором сафранина. В качестве активаторов фагоцитов рекомендуется использовать опсонизированный зимозан или акктиватор протеинкиназы С - форболмиристат ацетат. /2291к/ Об интенсивности радикалообразования судят по количеству диформазана, который откладывается в виде грубодисперсных темносиних гранул внутри или на поверхности активированного нейтрофила. /7062/ При микроскопии в каждом мазке подсчитывали 100 нейтрофилов, среди которых определяли процент клеток, содержащих отложения диформазановых гранул (НСТ-позитивные нейтрофилы). Далее расчитывали индекс активации нейтрофилов (ИАН) по формуле: А х 0 + Б х 1 + В х 2 + Г х 3 ИАН = , 100 где: А - количество клеток, не содержащих диформазановых отложений; Б - количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра; В - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины ядра; Г - количество клеток с диформазановыми отложениями по площади превосходит площадь ядра. НСТ-тест может быть сделан без дополнительной стимуляции (спонтанный НСТ-тест) или после стимуляции нейтрофилов in vitro (индуцированный НСТ-тест). /7062/ При патологии чаще ПОЛ растет.

Поэтому если лечение выбрано правильно, то процент активированных нейтрофилов быстро падает, опережая динамику лейкоцитарных сдвигов, СОЭ и др. /7062/ Сниженные показатели НСТ-теста 6 неблагоприятный исход (сепсиса) Повышенные показатели НСТ-теста 6 опасность развития гнойных осложнений после операции.

Нормальные показатели НСТ-теста 6 успешная терапия. /1365к/ [Преципитат с НСТ может образовывать гепарин. /1575к/90/] На стекла с прилипшими клетками капают 5 капель (0,14 мл) 1,03% раствора нитросинего тетразолия (17мг на 14 мл). Лизосомально-катионный тест (ЛКТ) Растворами исследуемых полипептидов по 50 мкл заполняли лунки иммунологического планшета, в которые вносили по 20 мкл цельной крови здоровых доноров, взятой со скарифицированной ранки пальца руки при помощи пипетки, предварительно промытой раствором гепарина 250 ед/мл.

Полученную взвесь клеток крови инкубировали 1 час при температуре 37С. После инкубации готовили мазки, сушили на воздухе при комнатной температуре и окрашивали по методу В.Е.Пигаревского и соавт. (1981) в 0,1 % забуференном спиртовом растворе зеленого прочного с рН 8,2 в течение 20 минут.

Дополнительную окраску мазков проводили 0,25% водным раствором азура А. Окрашенные препараты промывали дистиллированной водой, высушивали на воздухе и микроскопировали с использованием масляной иммерсии. При исследовании просматривали 100 гранулоцитов.