Подобные работы

Роль медсестры руководителя в организации лечения и ухода за больными с психическими расстройствами

echo "Подготовить больного к проведению той или иной процедуры или мероприятию требует подчас от медсестры – руководителя также много сил, умения, знания психологии больного и характера имеющихся псих

Иммунная система. Строение, состав, функции и др.

echo "Участие в воспалительном процессе (продукты деграда- - 3 - ции фибриногена и фибрина, ряд факторов ССК являются хемотаксическими факторами; фибриновые микротромбы способствуют некротическим проц

Иммунология репродукции

echo "Репродуктивная система как мужчин, так и женщин, составляет иммунологически динамическое окружение, где развивается иммунный ответ (ИО). Как лимфоидные клетки половой системы, так и медиаторы мо

Целлюлит

echo "Говорят о нем, как о большой проблеме молодые девушки и взрослые женщины. Что же такое целлюлит? В медицинском словаре дано определение: «Целлюлит – это фиброзное воспаление подкожной клетчатки.

Обследование женщин при подготовке к беременности

echo "Обследование женщин при подготовке к беременности. Известно, что организм взрослого человека не стерилен. Патогенные и условно-патогенные микроорганизмы, возбудители острых, хронических и лате

Пиогенные кокки - стафилококки

echo "Отдельные кокки, приметно 1 мкм в диаметре, имеют тенденцию объединяться в скопления, поскольку их деление происходит в трех взаимно перпендикулярных плоскостях и дочерние клетки сохраняют своео

Иммунология кожи

echo "Эпидермис может быть роговым, блестящим, зернистым, шиповатым и базальным. За эпидермисом располагается собственно дерма (кожа), в которой представлены кровеносные и лимфатические сосуды, потовы

Научно-практический подход к вопросам клиники и диагностики и хирургического лечения ЧМТ

echo "Комсомольск-на-Амуре 2000 г. Ч М Т - ва жн ей ша я медикос оциальная про б ле м а. А кт у а ль ность обус л овлена в ысокой распространенностью, с м ер т нос т ью , инвалидизацией н аибо ле е ак

Серологические реакции

Серологические реакции

Титром сыворотки считают максимальное разведение, дающее агглютинацию АГ. 0 0 0 0 0 = 0 0 / / / / / / / / / n 0 - клетка > - молекула антитела 1) _ Прямая РА В этой реакции антитела (агглютинины) непосредственно агглютинируют корпускулярные АГ (агглютиногены). - Зернистая агглютинация происходит при склеивании микробов, содержащих О-антиген. - Хлопьевидная агглютинация происходит с бактериями, имеющими жгутики (Н-антигены). а) Прямая реакция агглютинации (РА) - _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) Постановка реакции: Микробная суспензия + антисыворотка к микробу Результат: - хлопья (агглютинаты) Для определения микробного вида (серотипирования) на предметное стекло наносится 1 капля (0,05мл) диагностической сыворотки, разведенной физиологическим раствором 1:25. На вторую половину стекла наносится капля физиологического раствора (контроль). К каждой капле добавляется равный объем испытуемой культуры.Слегка покачивая стекло, наблюдать за течением реакции: феномен агглютинации проявляется выпадением хлопьев и просветлением жидкости в капле. В контроле микробная культура должна остаться мутной и гомогенной. - _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для раститровки сыворотки больного (определения титра АТ) Постановка реакции: Сыворотка больного, содержащая АТ к микробу --- раститровка + микробная суспензия (равное количество во все пробирки или лунки Результат: - хлопья (агглютинаты) микробов Для определения антител в сыворотке крови больного поставить в штатив 7 пробирок и налить в каждую из них по 0,5 мл физиологического раствора.

Добавить в первую пробирку 0,5 мл сыворотки больного, разведенную в 50 раз, перемешать. 0,5 мл из первой пробирки перелить во вторую, перемешать; из второй пробирки 0,5 мл перелить в третью и т.д. Из последней пробирки вылить для равенства объемов 0,5 мл в банку с дезраствором.В каждую пробирку добавляют по 2 капли антигена или диагностикума.

Оформить 2 контроля - контроль антигена (для исключения спонтанной агглютинации) и контроль сыворотки в исходном разведении 1:50. Рабочая схема РА: Ингредиенты Ряд пробирок ------------------------------------------------ 1 2 3 4 5 6 7 1. Физраствор 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 - 0,5 2. Сыворотка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 больного 1:50 Полученные титры 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 1:50 - 3. Диагностикум в каплях 2 2 2 2 2 - 2 Инкубация в термостате 2 часа при 370С, затем при необходимости 24 часа при комнатной температуре. Учет результатов реакции проводят через 24 часа по следующей схеме: ++++ полная агглютинация, жидкость прозрачная, выраженный осадок; +++ жидкость слегка опалесцирует, но осадок хорошо выражен; ++ или + сомнительная реакция, жидкость равномерно мутная, осадок отсутствует. - отрицательная реакция, жидкость равномерно мутная, осадок отсутствует.

Титром агглютинирующей сыворотки считается то ее максимальное разведение, при котором еще происходит реакция не менее, чем на три плюса.

Артефакты: - наличие СРБ, агглютинирующего микробы (стафилококки, стрептококки) - наличие перекрестных антигенов б) Прямая реакция гемагглютинации (РГА) - вирусами (эритроцитов любого вида животного) - при смешивании двух разногруппных проб крови (определение групп крови) Постановка реакции: Субстанция, склеивающая эритроциты (сыворотка, вирусы) + эритроциты --- хлопья Результат: - хлопья (означают присутствие АТ) Варианты постановки: - _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) - _Развернутая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для раститровки сыворотки больного (определения титра АТ) Материал с вирусом титруют от 1/10 до 1/1280. 0,5мл данного материала смешивают с 0,5мл 1-2% эритроцитов.

Инкубируют 30 минут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре.

Титром вируса считается его наибольшее разведение, при котором наблюдается агглютинация эритроцитов.

Прямая гемагглютинация, вызываемая бактериями, коррелирует с их способностью прикрепляться к клеткам макроорганизма, отражает вирулентные свойства. (Предложен метод селекции наиболее активных клеток из культуры путем их адсорбции на эритроцитах с последующим высевом на плотные среды.)-[11ц301-81] 2) _ Непрямая РА = РНГА (РПГА ; РНГА=РПГА ) (реакция пассивной или непрямой гемагглютинации) Варианты постановки: - _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) - _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для раститровки сыворотки больного (определения титра АТ) .0. .0. / / / n К носителю (эритроцитам, стафилококку, частицам латекса /латекс-агглютинация/ и пр. химическим способом 'пришивают' антигены, ампулируют и выпускают в биотехнологической промышленности как диагностикумы.

Постановка реакции: Сыворотка больного --- раститровка + диагностикум в каждую лунку --- Результат: - 'зонтик' (реакция агглютинации есть), - 'пуговка' (РА нет) Последняя ячейка с положительной пробой ('зонтиком') означает титр АТ. Сорбция на носителе либо АГ (РНГА=РПГА), либо АТ (обратная РПГА). Реакция ставится в двух вариантах.

Антиген (РПГА) или антитела (РНГА) связываются с крупным носителем с последующим выявлением уровня специфических иммуноглобулинов или антигена.

Исследуемый антиген 'сшивается' танином или глютаровым диальдегидом с эритроцитами или частицами латекса.

Сыворотка больного, прогретая 30 минут при 56оС, раститровывается (0,5мл) и смешивается с 2 каплями эритроцитарного диагностикума. 3) _ Проба Кумбса . (непрямая пассивная гемагглютинация; антиглобулиновый тест) Для постановки этой реакции необходима антиглобулиновая сыворотка, которую получают путем иммунизации кролика иммуноглобулинами человека.

Используется для определения неполных (функционально одновалентных) антител, например, 'ро'-антител к эритроцитам плода при резус-конфликте, ряд аутоантител, АТ к некоторым микробам и пр.

Эритроциты плода в условиях in vivo не агглютинируют, однако при обработке их in vitro антисывороткой к гамма-фракции антител человека происходит РА на стекле (= _ориентировочная . реакция Кумбса). К сыворотке добавляется антиген (резус-фактор) и затем антисыворотка против гамма-глобулинов, что вызовет агглютинацию загруженных эритроцитов. _Развернутая . реакция Кумбса (в ряду пробирок или лунок) применяется для определения титра циркулирующих неполных антител в сыворотке больного. 0 0 / / / / -АТ 1 / / / АТ 2 АТ 2 АТ 2 n Постановка реакции: Сыворотка (АТ 1 ) --- раститровка + эритроциты (с Rh-антигеном) + антисыворотка к Fc-фрагменту Ig G (АТ 2 ). Результат: - 'зонтик' (реакция агглютинации есть), - 'пуговка' (РА нет) Последняя ячейка с положительной пробой ('зонтиком') означает титр АТ. 4) _ Реакция коагглютинации (РКОА , РКА ) Варианты постановки: - _Ориентировочная РА . (на предметном стекле) --- хлопья - _Развернумая РА . проводится в ряду пробирок или лунок для раститровки сыворотки больного (определения титра АТ) L[+] 0> St. n К носителю - клеткам инактивированного золотистого стафилококка (Staphylococcus aureus), несущего на своей поверхности белок А (функциональный аналог FcR) добавляют необходимые АТ (антисыворотку) и после инкубации - исследуемую жидкость с предполагаемыми АГ-ми.

Постановка реакции: Стафилококковый диагностикум + АГ Результат: - 'зонтик' (реакция агглютинации есть), - 'пуговка' (РА нет) Последняя ячейка с положительной пробой ('зонтиком') означает титр АТ. Реакция Ко-агглютинации (РКА) предложена в 1973г. Kronvall для постановки диагноза пневмококковой инфекции.

Сейчас она используется для диагностики эшерихиозов, коклюша, менингококковой, стрептококковой инфекции, сальмонеллезов и шигеллезов, а также для обнаружения некоторых бактериальных токсинов. /2119к/85/ Реакция пригодна для идентификации различных антигенов путем агглютинации стафилококков, сенсибилизированных антителами против детерминант бактериальной, вирусной или неинфекционной природы. /2111к/ Например, для индикации шигелл зонне в молоке, кефире и в материалах от людей. Для определения чувствительности РКОА ставили с 10-кратными разведениями 1 млрд. микробной взвеси шигелл Зонне.

Чувствительность РКОА составила 108-109 микробных тел в 1 мл взвеси. /2111к/ Стафилококковый реагент выпускается Ленинградским НИИЭМ им.

Пастера и используется его 2% взвесь. Для сенсибилизации используются сыворотки с титром антител в РПГА не ниже 1:12800. /2111к/ На предметное стекло капают 2 капли по 0,1 мл диагностикума и испытуемый материал.

Положительным результатом считалось образование агглютината с полным просветлением смеси. (Контроль - с физраствором и реакция с заведомо инфицированным материалом.) Определение энтеротоксина в реакции коагглютинации Культуру сальмонелл осаждают (8000 об./мин.;20 минут), к осадку микробов добавляют 0,5 мл дистиллированной воды, готовят лизат, вновь центрифугируют (8000 об./мин.;20 минут) и с надосадком (супернатантом) проводят реакцию. /1804к/88/ В реакции используют диагностикум - золотистый стафилококк с 'пришитыми' к нему антителами к токсину. 2-3 капли реагента + 1 капля супернатанта культуры сальмонелл больного --- РА (оценка +, ++, +++, ++++ после 3-минутного покачивания). /1804к/88/ 5) _ РТГА (реакция торможения гемагглютинации) Гемагглютинин (НА) вирусов заблокирован антителами (первые ячейки с ' _пуговками .' = РА нет): L[+] Эр. Эр. агглютинации эритроцитов нет 0 - вирус (=торможение > - антитела агглютинации) При 'следовых' количествах антител к гемагглютитину (НА) или их отсутствии гемагглютинин ('клей для эритроцитов') вирусов остается 'открытым' (не закрыт антителами) и происходит склеивание эритроцитов (последние ячейки с ' _зонтиками .' = РА есть): L[+] 0 Эр. 0 Эр. 0 n а) Определение титра АТ к определенному вирусу (добавляется антисыворотка к НА /гемагглютинин видоспецифичен/ данного вируса). Постановка реакции: Сыворотка больного --- раститровка + суспензия музейных инактивированных вирусов (или диагностикум) + эритроциты любого вида животного Результат: - 'зонтик' (реакция агглютинации есть, АТ нет - 'пуговка' (РА нет, АТ есть Последняя ячейка с положительной пробой ('пуговкой') означает титр АТ. б) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у больного по выделенной культуре Постановка реакции: 3 ряда лунок в иммунологической планшете: Антисыворотка к вирусу гриппа типа А --- раститровка Антисыворотка к вирусу гриппа типа В --- раститровка Антисыворотка к вирусу гриппа типа С --- раститровка + Вирус-содержащий материал от больного (культура, носовая жидкость) во все 3 ряда (Или наоборот, раститровка в 3 рядах вирусов + АТ, если нужно сориентироваться в количестве вирусов) + эритроциты любого вида животного Результат: - ряд с 'пуговками' означает тип вируса. - Сыворотку титруют (1/10-1/2560) - 0,25мл; - добавляется вирус в четырехкратном титре (разведение в 4 раза от исходного титра) - инкубируют 30 минут при 37оС - добавляют 0,5мл 1-2% взвеси эритроцитов - инкубируют 30 минут при 37оС или 45 минут при комнатной температуре. в) Определение типа вируса, допустим, гриппа (А, А или С) у больного по наличию антител в сыворотке крови Постановка реакции: 3 ряда лунок в иммунологической планшете: Сыворотка больного --- раститровка в 3 рядах + Музейный вирус типа А (в первый ряд) + Музейный вирус типа В (во второй ряд) + Музейный вирус типа С (в третий ряд) + эритроциты любого вида животного Результат: - ряд с наибольшим количеством 'пуговок' означает наибольший титр АТ у больного к данному типу вируса, что предположительно говорит о соответствующем гриппе (для доказательства оценивают титр АТ в динамике с интервалом в 2 недели; при увеличении титра минимум в 4 раза можно говорить об острой инфекции и соответствующем заболевании). РЕАКЦИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ Реакции иммобилизации основаны на способности специфических АТ, циркулирующих в сыворотке больных, подавлять подвижность различных микроорганизмов. На практике нашли применение реакции иммобилизации бледной трепонемы и холерного вибриона. РЕАКЦИИ ПРЕЦИПИТАЦИИ (РП) - реакции взаимодействия между антигеном и антисывороткой с образованием видимого 'осадка' (преципитата) - преципитирующих иммунных комплексов (ПИК). МАТ (моноклональные АТ) одновалентные, поэтому в РП пока не используются. РП _В жидкой фазе . _В агарозе . (1%) - реакции кольце- - в т.ч. электрофоретические преципитации (в этом случае агароза варится - нефелометрия на веронал-мединаловом буфере (ВМБ, рН 8,6) Механизм взаимодействия антигенов и антител: АГ АГ=АТ АТ (пропорциональное количество АГ и АТ;1:1) о о / / / / / Y Y АГ о о о о о о о Y Y АТ о / / / / / Y о о Y ПИК (преципитирующие ИК, преципитат) 1) _ Реакция кольцепреципитации - АГ = - зона преципитации (помутнения) в пробирке или капилляре - Антисыворотка а) _Определение С-реактивного белка . (СРБ): капилляр наполовину заполняют антисывороткой к СРБ и дополняют сывороткой больного.

Капилляр вставляют в пластелиновую пробку и оставляют до утра.

Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности деструктивных процессов в организме). Треть капилляра заполняют антисывороткой и через этот же коне ц треть - исследуемой сывороткой.

Капилляр покачивают 12-15 раз для смешивания ингредиентов и устанавливают вертикально на пластилиновый штатив. оставляют 24 часа при комнатной температуре.

Помутнение на границе раздела свидетельствует о наличии СРБ в кровотоке (количество СРБ пропорционально интенсивности деструктивных процессов в организме). Результат оценивают по высоте преципитата в капилляре. б) _Диагностика сибирской язвы Прокипяченый инфицированный материал + антисыворотка (медленно наносить; по стенке пробирки стекает под слой АГ) Инкубация несколько минут. Зона помутнения свидетельствует о присутствии АГ в материале. 2) _ Нефелометрические, тербидиметрические методы Принцип нефелометрии заключается в измерении количества света, рассеиваемого частицами (ПИК) в жидкой среде. Для нефелометри оптимальны растворы низкой концентрации (в отличие от турбидиметрии, для которой оптимальны растворы высокой концентрации, поскольку в этом случае измеряется потеря проходящего света). Чувствительность метода - 100 мкг/мл антител или антигена при исследовании цельной сыворотки и 1 мкг/мл при исследовании чистых растворов.

Данным методом можно проводить до 120 анализов в час. Время образования ИК можно значительно сократить, если ее проводить в 4% полиэтиленгликоле с М. 6000Д. 3) _ Метод преципитации в геле по Оухтерлоню Стекла или чашки Петри заливают 1-2% агаром или агарозой. После застывания агара вырезают по трафарету лунки. В одни лунки вносят исследуемые сыворотки (препараты), в другие, расположенные напротив - соответствующие антисыворотки.

Пластины инкубируют во влажной камере в течение 24-48 часов.

Варианты постановки: - 2 лунки (диаметром 3-5 мм) на расстоянии 3-5 мм друг от друга (одна с АТ, другая с АГ); - в центре лунка с антисывороткой, вокруг лунки с разными пробами АГ-содержащего материала (или наоборот, в центре - АГ, по периферии - АТ); - бороздка (или полоска пропитанной фильтровальной бумагой, наложенной на агарозу) с антисывороткой (АТ-ми), по бокам лунки с АГ или бляшки микробов, синтезирующих токсин (определение токсигенности дифтерийной палочки). 4) _ Метод преципитации в геле по Манчини _ (метод радиальной иммунодиффузии - РИД) / ---- зона преципитации о-- ---- лунка с точно дозированным количеством --- / сыворотки Метод количественного определения антигенов основан на измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара, в котором предварительно диспергирована моноспецифическая антисыворотка. В слое агара пробойником вырезают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 15мм одна от другой. В лунки первого ряда вносят с помощью микрошприца по 2мкл антигена (или стандартной сыворотки) в разведениях 1/1, 1/2, 1/4, 1/8. Лунки следующих рядов заполняются испытуемыми препаратами.

Пластины инкубируют во влажной камере в течение 24 часов (пластины с анти-Ig M сывороткой - 48 часов). По окончании инкубации измеряют диаметры колец преципитации.

Концентрацию антигена определяют по калибровочной кривой.

Например, определение концентрации Ig M,G,A в сыворотке крови больных. 5) _ Ракетный электрофорез (электроиммунодиффузия) 1/4 о=== о - лунки с точно дизированным 1/2 о====== количеством сыворотки 1/1 о========== === - зоны преципитации - + (измеряется длина зон, мм) Катод Анод 1/1, 1/2, 1/4 - разведения стандартной сыворотки (т.е. сыворотки с известным количеством антител) Ставятся для построения калибровочной кривой. В 1966г. Laurell разработал метод, сочетающий иммунодиффузию с электрофорезом.

Антиген движется в геле агарозы, содержащем антисыворотку. Для электрофоретических реакций преципитации агарозу расплавляют в веронал-мединаловом буфере (рН 8,6) в водяной бане, остужают до 52 о С, смешивают с антисывороткой и заливают на стекло. После застывания (через 5 минут) вдоль кромки слоя геля делают ряд лунок, в которые помещают исследуемый материал. В слое геля создают электрическое поле, благодаря которому антиген входит в гель. Зона преципитации приобретает вид 'ракеток'. Высота 'ракеты', образующейся в результате реакции, прямо пропорциональна концентрации антигена (она измеряется от верхней границы лунки до высоты пика). 6) _ Противоточный или встречный электрофорез . (экспресс-диагностика вирусных и др. инфекций) Встречный ИЭФ (иммуноэлектрофорез) был применен Бендарид в 1969г.

Электрическое поле усиливает способность к взаимодействию низкореактогенных АГ и АТ. Чувствительность метода в 10 раз превышает чувствительность метода двойной иммунодиффузии по Оухтерлони. /2400к/ Основное условие метода - наличие электрофоретической подвижности АГ. - 0 0 0 + Катод АТ АГ АТ Анод ПИК В две лунки геля заливают антиген и антитела, пластину ставят в камеру для электрофореза и включают напряжение.

Электрическим полем значительно ускоряется движение компонентов и реакция преципитации проходит за 30-40 минут.

Экспресс-диагностика 7) _ Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) + о о о о о о о о о о - Постановка реакции: - В лунки заливается исследуемая смесь веществ, пластина с агарозой ставится в электрофоретическую камеру на ночь для разгонки белков. - Вынимается агароза из бороздок. В них заливается антисыворотка (удобнее чередовать антицельную сыворотку с моноспецифической к искомому компоненту). Ночь во влажной камере.

Результат: оценивается степень чистоты препарата по количеству 'лишних' дуг зон преципитации примесей с антицельной сывороткой (если препарат получали из крови). В геле, приготовленном на веронал-мединаловом буфере (рН 8,6), по трафарету делаются бритвой полоски и лунки. Гель из лунок вынимается (из бороздок нет) и лунки заполняют смесью антигенов или исследуемой сывороткой.

Пластина ставится в прибор для электрофореза и в течение ночи проводится разгонка исследуемых белков. На следующий день освобождаются от геля бороздки и заполняются моноспецифическими и полиспецифическими (часто антицельной) антисыворотками.

Пластина оставляется на ночь во влажной камере для реакции преципитации. 8) _Перекрестный электрофорез Смесь исследуемых белков разгоняется поперек пластины в электрическом поле, затем к полоске геля с разделенными белками приливается расплавленный гель с антисывороткой к исследуемым компонентам и разгонка проводится в продольном направлении.

Формируются широкие отдельные зоны преципитации исследуемых компонентов белков. РЕАКЦИЯ ФЛОККУЛЯЦИИ 0 0 - хлопья флоккулята / / / (помутнение в пробирке) n 0 - молекула антигена (токсина или др.) > - молекула антитела В результате взаимодействия токсина или анатоксина с антитоксической сывороткой выпадают хлопья флоккулята.

Наиболее ранняя флоккуляция наблюдается в пробирке, где антиген и антитело содержатся в эквивалентных соотношениях. Одна флокуллирующая единица токсина (Lf - Limes flocculationis) в 1 мл определяется минимальным количеством токсина, дающим начальную флоккуляцию с 1 международной единицей (МЕ) сыворотки. 2мл токсина (20 Lf в 1 мл) смешивают в пробирках с разными количествами сыворотки (0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл), инкубируют 30 минут при 45оС до выпадения хлопьев в одной из них. Если флоккуляция произошла в 3 пробирке, значит, в 0,4мл сыворотки находится 40МЕ. Следовательно, 1мл сыворотки содержит 40:0,4=100 МЕ. РЕАКЦИЯ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦИИ (ИФМ - иммуно-флюоресцентный метод) 1) _Прямой метод . иммунофлюоресценции (по Кунсу) основан на взаимодействии антител, меченых флюорохромом, с антигеном, который находится на клетке, в клетке или в тканях. В качестве флюорохрома используют - флюоресцеинизотиоционат (ФИТЦ), дающий зеленое свечение в УФ-ых лучах; - тетраметилродаминизотиоцианат (ТРИТЦ) с оранжево-красным свечением. /2551к/ Y - АТ Y * - метка флюорохрома (светя- * щаяся в темном поле зрения люминесцентного микроскопа) Предметное стекло с препаратом (после промывки от несвязавшихся АТ) Постановка реакции: Фиксированный мазок + диагностическая сыворотка с АТ-ми, мечеными ФИТЦ. Отмывка от несвязавшихся антител.

Люминесцентная микроскопия (при положительном результате видно свечение.

Материал (препарат ткани, микроорганизмов или антигена) наносится на стекло, фиксируется 15 минут в спирте или в пламени горелки, обрабатывается флуоресцирующей сывороткой (15-30 минут при комнатной температуре), промывается 15 минут физиологическим раствором; проводится люминесцентная микроскопия.

Отсутствие свечения свидетельствует об отсутствии антигена на препарате. Для получения флуоресцирующих антител к раствору иммуноглобулинов добавляют раствор флуоресцетина изотиоцианата натрия (можно 5-диметиламино-1-нафталинсульфонилхлорид и изотиоцианат лизамин родамина В 200). 2) _Непрямой метод Y > - АТ 2 (меченые - АТ 1 флюорохромом) Y * - метка флюорохрома > * Предметное стекло с препаратом (после промывки от несвязавшихся АТ) Постановка реакции: _1 вариант Фиксированный мазок больного (микробы больного) + _диагностическая сыворотка . (обычные АТ; первого порядка), допустим, кролика.

Отмывка от несвязавшихся антител. + Антисыворотка против иммуноглобулинов кролика с АТ-ми (второго порядка), меченными ФИТЦ. Отмывка от несвязавшихся антител.

Люминесцентная микроскопия (при положительном результате видно свечение. _2 вариант Фиксированные мазки музейных микробов (диагностикума), + (раститрованная) _сыворотка больного Отмывка от несвязавшихся антител. + Антисыворотка против иммуноглобулинов (АТ второго порядка), меченными ФИТЦ. Отмывка от несвязавшихся антител.

Люминесцентная микроскопия (при положительном результате видно свечение.

Антисыворотку к иммуноглобулинам кролика получают иммунизацией барана иммуноглобулинами кролика. Метод иммунной флюоресценции применяют для идентификации риккетсий и других бактерий, вирусов, а также для определения рецепторов и АГ-ов животных клеток человека и животных. ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ АНАЛИЗ (ИФА) ELISA-МЕТОД=РЭМА (Enzyme-linked immunosorbent assay = реакция энзим-меченных атомов) Метод независимо разработали в начале 70-х годов шведские исследователи Энгвалл и Перлманн, голландские ван Веемен и Шуур и американские исследователи под руководством Рубинстайна. К настоящему времени созданы многочисленные модификации базовой методики и наибольшее распространение получил гетерогенный ИФА на твердой фазе ( _твердофазный ИФА .). Коммерческие МАТ (или АГ) фиксируют на лукнах пластиковых панелей, реже иммобилизуют на бусах или нитроцеллюлозных мембранах. /2400к/ Лунка иммунологической планшеты с 'пришитыми' антигенами (диагностические планшеты) > - АТ 1 (антитело первого порядка) АГ> Y Y * - АТ 2 (молекула АТ второго порядка, меченая пероксидазой хрена) * - пероксидаза (ПХ) хрена Н 2 О 2 Н 2 О + [O] ПХ радикал кислорода + раствор Н 2 О 2 и красителя (хромогена), изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода (орто-фенилендиамин) --- спектрофотометрия (под вертикальным лучом) После каждого этапа обработки планшета промывается физраствором или буфером. ИФМ можно определить белки, содержащиеся в количестве нескольких нанограммов в 1 мл. В качестве ферментных меток используют пероксидазу хрена, глюкозоксидазу, бета-галактозидазу или щелочную фосфатазу. Этапы: Первым этапом является связывание моноспецифических антител (или антигена, если искомым белком является антитело) на твердом субстрате, обычно на стенках пластиковой пробирки или планшеты.

Связывание происходит путем физической адсорбции белка на гидрофобной поверхности. - Полистироловая (полистереновых) планшетка обрабатывается антигеном для их сорбции (или антителами). - Добавляется альбумин (забиваются все свободные сайты связывания, чтобы не было затем неспецифической сорбции антител). - Обработка антителами или сывороткой больного, содержащей предполагаемую разновидность антител. - Добавляется антисыворотка, меченная ПХ (пероксидазой хрена). - Приливается реактив АВТS или др., который окрашивается после воздействия пероксидазы. Можно использовать смесь перекиси водорода и хромогена (ортофенилдиамина, изменяющего окраску в зависимости от количества радикальных форм кислорода от светло-желтой до коричневой). - О наличии и количестве АТ судят по изменению цвета и интенсивности окраски раствора.

Измерение интенсивности окраски на спектрофотометре /СФ/. [ИФМ можно проводить двумя путями - по непрямому (описанному выше) и конкурентному типу. В первом случае конкурентные отношения отсутствуют: исследуемая биологическая жидкость реагирует с твердофазными антителами, после чего на удаляется из и в реакцию вводят меченые ферментом антитела, которые связываются уже иммобилизованным антигеном. В этом случае ферментативная активность прямо пропорциональна количеству антигена в исследуемом материале. Во втором случае антиген, меченный ферментом, конкурирует с немеченым исследуемым антигеном за выделенные на твердой фазе антитела, и ферментативная активность обратно пропорциональна количеству антигена в исследуемом образце.] В качестве твердой фазы используют вещества различного химического состава - полистирен, полипропилен, поливинил, гели декстрана, агарозы, полиакриламида, целлюлозы, нитроцеллюлозы, нейлон. РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД /АНАЛИЗ/ (РИМ=РИА) РИСТ - радиоиммуносорбентный метод Ставится аналогично ИФА, но с использованием антител, меченых радиоактивным изотопом. > - АТ 1 (антитело первого порядка) АГ> Y Y * - АТ 2 (молекула АТ второго порядка, меченая изотопом) * - радиоактивная метка --- счетчик радиоактивности Работа проводится в радиоизотопных лабораториях.

Используются антитела, меченные радиоактивным элементом - иодом ( 125 I, 131 I) или др. - с последующим измерением радиоактивности. Если предыдущие иммунохимические методы способны улавливать концентрацию белка не ниже 1 мкг/мл, то с помощью РИМ можно определить концентрации, измеряемые в пикограммах, поэтому метод РИА считается одним из подходящих количественных методов иммунохимического анализа. Учет реакции проводят по убыванию или по возрастанию радиоактивности (в зависимости от методики РИА) с помощью специальных счетчиков бетаили гамма-излучения. Метод высокочувствителен, но постепенно вытесняется иммунофлюоресцентным анализом. /2551к/ ИММУНОБЛОТТИНГ и дот-микросвязывание Постановка методики: - Вертикальный электрофорез пробы в течение ночи - Снятие отпечатка на нитроцеллюлозную бумагу (полоски или цельную) - Инкубация полосок бумаги в растворе антисыворотки к искомому антигену.

Промывка от несвязавшихся АТ. - Инкубация в растворе противовидовой антисыворотки (растворе АТ второго порядка), меченых ПХ (пероксидазой хрена) - + раствор Н 2 О 2 и красителя, изменяющего цвет в присутствии радикалов кислорода.

Присутствие АГ расценивается по наличию окрашенных красителем пятен на бумаге. Метод основан на разделении полипептидов в ПААГ (полиакриламидном геле) и анализе разделения иммунохимическими методами после переноса разделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану, на которой белки доступны для любого вида твердофазного иммуноанализа (иммуноферментного или радиоиммунного). Этапы: 1. Электрофорез исследуемой смеси пептидов и маркеров с известной молекулярной массой в ПААГ. 2. Окраска геля нитратом серебра. 3. Перенос следов белка на нитроцеллюлозную бумагу или мембрану на основе нейлона (отпечаток геля) с получением реплики электрофореграммы.

Процесс переноса называется блоттингом, а полученный отпечаток - блотом или блотограммой. 4. Обработка бумаги в полиэтиленовом пакете в антисыворотке к исследуемым антигенам.

Промывка. 5. Обработка антителами к фракции иммуноглобулинов, связанных с пероксидазой или с биотином (ИФМ). 6. Окраска авидин-пероксидазой или диаминбензидином с добавлением перекиси водорода.

Промывка.

Высушивание. . РЕАКЦИЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ /РН/ _ 1) РН вирусов в цветной пробе (в культуре ткани). Допустим, у больного грипп типа В: РН В В В + АТ к А + АТ к В + АТ к С (+ антисыворотка - ' - (+ антисыворотка к вирусу типа А) к вирусу типа С) Во второй пробирке произойдет нейтрализация вируса (РН). Добавленные клетки останутся живыми.

Постановка методики: Вирусная культура + антисыворотка к белкам адгезии вирусов (НА) --- инактивация вируса (неспособность проникать в клетки для репродукции) + культура клеток --- гибели нет (метаболизм клеток продолжается, среда закисляется и окраска среды 199 меняется на желтую. При выявлении одного, допустим, из 3 типов вирусов гриппа (А,В,С) в 3 пробирки добавляют исследуемую культуру вируса (аллантоисную жидкость куриного эмбриона), затем в каждую пробирку свою антисыворотку (против А, против В, против С) и после прединкубации - культуру клеток в среде 199. В двух из трех пробирок АТ не свяжут вирусы, вирусы проникнут в клетки; клетки погибнут, метаболизм прекратиться (среда перестанет желтеть и останется исходной - малиновой). _ 2) РН вирусов в культуре ткани . или курином эмбрионе по нейтрализации ЦПД. Ставится аналогично, но наблюдается не изменение цвета питательной среды, а (чаще под микроскопом) отсутствие ЦПД (цитопатогенного действия вируса) - образование многоклеточного синцития, гигантских многоядерных клеток, появление включений, везикуляция клеток и пр. _ 3) РН токсина антитоксической сывороткой а) in vitro - Реакция флоккуляции (хлопьеобразования) б) in vivo - Например, определение типа токсина Clostridium botulinum при ботулизме.

Клостридии ботулизма способны продуцировать 7 серотипов токсина - А,В,С,D,E,G,F, из которых в нашей стране встречаются чаще токсин типа А, типа В и типа Е. Допустим, человек отравился токсином Е: РН Е Е Е + АТ к А + АТ к В + АТ к Е мышь погибнет мышь погибнет мышь выживет Токсин-содержащий материал разливают по 3 пробиркам и добавляют в первую - антисыворотку к токсину А, во вторую - антисыворотку к токсину В, в третью - антисыворотку к токсину Е. В 3 пробирке произойдет образование ИК, т.е. нейтрализация токсина (РН). Для выявления данной пробирки содержимое вводят трем мышкам.

Третья мышь выживет.

Минимальной летальной дозой токсина считается количество токсина. которое при подкожном введении морской свинке весом 250г вызывает ее гибель в течение 4-5 дней. 4) Феномен гашения сыпи (in vivo), например, при диагностике скарлатины. Для диагностики скарлатины в область наиболее обильной сыпи вводят антисыворотку к эритрогенному токсину; если у больного скарлатина, то сыпь в месте инъекции пропадает. 5) РН для определения напряженности антитоксического иммунитета к дифтерийному токсину (проба Шика), скарлатинозному токсину (проба Дика) в здоровом организме. В область предплечья внутрикожно вводят определенное количество соответствующего токсина (1/40 DLM). При наличии в оганизме антитоксинов произойдет нейтрализация токсина и реакция будет отрицательной. При отсутствии антитоксинов (антитоксических АТ) в организме возникает воспалительная реакция (покраснение) на месте введения токсина. /2551к/ Подкожное введение эритрогенного токсина иммунным лицам приводит к нейтрализации токсина (покраснения не будет). РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) _ Реакции иммунного лизиса . используются в нескольких вариантах 1) Для определения АТ к эритроцитам барана (ЭБ) 2) Для определения HLA на В-лимфоцитах (лимфоциты + МАТ к определенному АГ системы HLA + комплемент --- лизис клеток + гемсистема - ЕА (эритроциты /Е/ барана, нагруженные антителами /А/ к ним /ЕА/). 6-12 ячеек из 100 будут с целыми эритроцитами, остальные - с лизированными (ИК нет, нет активации комплемента, нет потребления комплемента, свободный комплемента лизирует ЭБ). РСК. 3) Для определения титра АТ к любому АГ (РСК). В реакциях иммунного лизиса специфические АТ взаимодействуют с различными клетками, в том числе с бактериями и простейшими, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и последующему лизису клеток. Среди них известны реакции гемолиза и вибриолиза. /2400к/98/ Реакция гемолиза считается активной при использовании АТ к эритроцитам барана. При пассивной реакции иммунного лизиса производят адсорбцию антигена на эритроцитах барана с последующим добавлением искомых антител к АГ-ну и комплемента.

Определение титра антител по РСК (реакции связывания комплемента) 1/10 1/100 1/1000 и т.д. (раститровка) = 10 -1 = 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -7 о о о о - - - - ________________________/ _________________________/ Контроли Эритроциты барана целы Эритроциты барана лизированы (муть или осевшие на дне) Постановка методики: - Раститровка сыворотки для определения титра АТ + АГ (музейная культура микробов, лекарственный препарат, анатоксин и пр. --- ИК в первых пробирках по убывающей + комплемент (сыворотка морской свинки) --- связывание ИК с C1q. Инкубация 15 минут. + ЕА (гемсистема; другой вид ИК). Инкубация 15 минут. --- Лизиса в первых пробирках нет, т.к. C1q весь связан с первым типом ИК. АГ ЭБ С --- гемолиза эритроцитов нет (положительная РСК) АТ АТ ИК ИК [Скомплемент] АГ ЭБ С --- гемолиз эритроцитов (отрицательная РСК) АТ АТ ИК нет или мало ИК (антител к искомому АГ нет или мало) Примечание : - Сыворотка больного предварительно инактивируется от собственного комплемента (56 о 20 минут), поскольку активность комплемента у разных больных разная (сбои в результатах). - Предварительно отрабатывается рабочая доза АГ (не влияющая сама по себе на реакции активации комплементарного каскада). - Подбирается рабочая доза комплемента (избыток недопустим, так как C1q будет оставаться и на ИК второго порядка). 1. Приготовление 5% суспензии эритроцитов барана (Е): 0,5 мл осадка отмытых эритроцитов + 9,5 мл физраствора. 2. Определение титра гемолитической сыворотки (антител /А/ к эритроцитам барана): Титром гемолитической сыворотки считается максимальное разведение в объеме 0,5 мл, при котором наблюдается полный гемолиз 0,5мл 3% взвеси эритроцитов барана в присутствии 0,5мл комплемента (1:10). Пробы выдерживаются при температуре 370С в течение 1 часа. 3. Приготовление рабочего раствора гемолитической сыворотки (1:3): Например, исходный титр 1:2700; 2700 : 3 = 900, т.е. сыворотку необходимо развести в 900 раз (взять 1/900 часть от конечного объема). Если надо 10 мл гемсистемы, то нужно взять 10:900=1/90мл=0,011мл исходной гемолитической сыворотки. 4. Приготовление гемолитической системы (индикаторной системы для комплемента): Смешиваются равные объемы 5% суспензии эритроцитов барана и гемолитической сыворотки (1:6); при этом сыворотка при непрерывном встряхивании выливается в суспензию эритроцитов, а не наоборот. Смесь встряхивается 5 минут и инкубируется 30 минут в термостате.

Отмывается. 5. Определение рабочей дозы комплемента: В качестве источника комплемента можно использовать сыворотку здоровых доноров (при этом комплемент сыворотки инактивируется прогреванием в течение 30 минут при 560С) или лиофилизированную сыворотку морской свинки. Титр комплемента - то наименьшее количество комплемента, которое будучи смешанным с 0,5мл гемолитической сыворотки (в трехкратном титре), гемолизирует 0,5мл 3% взвеси эритроцитов в течение 30 минут. Для титрования пользуются основным разведением комплемента 1:10 и разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5мл. Затем в каждую пробирку добавляют физраствор до 1,5мл и 1 мл гемолитической системы.

Инкубируют 30 минут при 370С и определяют титр комплемента.

Параллельно ставится два контроля - контроль гемолитической сыворотки (с физраствором) и контроль комплемента.

Определив титр комплемента, высчитываем рабочую дозу, которая представляет собой титр комплемента, увеличенный на 20-30%, так как комплемент в опыте подавляется антигеном. 6. Определение рабочей дозы антигена: Раститровывают антиген в конечном объеме 1мл, затем добавляют комплемент, штатив встряхивают и оставляют на 1 час при 370С. К смеси приливают по 1мл гемолитической системы и инкубируют 1 час.

Титром считается наименьшая доза, при которой прекращается задержка гемолиза, т.е. отсутствует его комплементарное действие. Для постановки РСК берут рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2 - 2/3 ее титра во избежание комплементарного действия при постановке реакции. 7. Постановка реакции РСК. - Раститровывают сыворотку больного, предварительно прогретую при 520С в течение 20 минут для инактивации собственной системы комплемента. - Добавляют рабочую дозу антигена, - комплемента и инкубируют 10-30 минут при 370С. - Затем вносится гемолитическая система и штатив инкубируется еще 30 минут при 370С. Задержка гемолиза свидетельствует о наличии антител к используемому антигену в сыворотке больного. Учет РСК с парными сыворотками. (титром специфических в данному антигену антител считается титр последнего разведения сыворотки, полностью тормозящего гемолитическую реакцию.) Титром гемолизина считается наибольшее разведение гемолизина, с которым получается полный гемолиз 0,5мл взвеси бараньей крови в присутствии комплемента.

Реакция Вассермана (РСК) используется для диагностики сифилиса.

Антигеном служит экстракт пораженного органа или другой аналогичный материал. II. _ ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЦЕПНАЯ ПОЛИМЕРАЗНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) - Не серологическая (без использования АГ и АТ), но также гибридизации фрагментов ДНК и РНК. высокоспецифическая диагностическая реакция. ПЦР - чрезвычайно чувствительный метод, теоретически для получения результата достаточно иметь в среде одну молекулу ДНК. /2400к/ ПЦР была разработана Мюллесом в 1983г. на основе технологии Методы ДНК-гибридизации и ЦПР используются для геносистематики и идентификации патогенных микроорганизмов. /2287к/96/ Основа метода - катализируемое ДНК-полимеразой многократное образование копий (амплификация) определенного участка ДНК. Этапы метода: - термическое разделение 2-нитевой молекулы ДНК на отдельные цепочки (30-40с. при 93-95 о С), - охлаждение среды и - внесение праймеров, комплементарных нуклеотидным последовательностям обеих цепочек. Для запуска реакции используют синтетические _ праймеры . - олигонуклеотиды, состоящие из 10-20 нуклеотидов, взаимодействующие с окончаниями последовательностей и образующие последовательности в 50-1000 оснований. Затем в среду вносят термостабильную полимеразу (tag-полимеразу /от вида бактерии Thermus aquaticus/), что запускает образование вторичных копий цепей ДНК, после чего образующиеся 2-нитевые молекулы ДНК снова подогревают.

Образующиеся отдельные цепочки остужают, вносят праймеры и снова повторяют процедуру прогрева и охлаждения. /2400к/ После 30-80 циклов накопления копий ДНК проводят их идентификацию методом электрофореза. /2400к/ Для подтверждения принадлежности ДНК возбудителю молекулы можно подвергнуть рестрикции специфическими эндонуклеазами или провести реакцию ДНК-гибридизации. /2400к/ ПЦР позволяют анализировать геномную ДНК или РНК-транскрипты, выделенные из единственной клетки. И хотя эти методы не требуют большого количества клеток, их ограничения связаны с доступностью специфических праймеров и их, как правило, применяли для выявления уже известных или родственных им генов. Такое ограничение было преодолено после разработки методов, позволивших амплифицировать весь спектр мРНК. В них использовалась природная особенность всех мРНК нести поли(А+)-последовательность на 3'-конце.

Комплементарная ДНК (кДНК), полученная с мРНК в реакции обратной транскрипции, приобретала таким образом сайт связывания одного из праймеров для амплификации в ЦПР. Другой сайт был образован путем добавления гомополимерного хвоста с помощью терминальной трансферазы.