Стафилококки. Выявление резистентности к метициллину и другим b-лактамным антибиотикам методом скрининга

Резистентность стафилококков к оксациллину ( метициллину ) может быть обусловлена тремя основными механизмами: q продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) – ПСБ-2а (фермента, участвующего в синтезе клеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном mecА – классическая, или истинная резистентность к метициллину ( оксациллину ); q инактивацию вследствие гиперпродукции бета лактамаз; q модификацию нормальных ПСБ. С клинической точки зрения, важно дифференцировать штаммы с классической ( mecА-обусловленной ) резистентностью от штаммов с двумя другими редковстречающимися механизмами резистентности , обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью , терапия бета-лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами , карбапенемами ) будет неэффективна. Кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков за исключением гликопептидов ( ванкомицин , тейкопланин ). Фенотипические характеристики, которые могут помочь дифференцировать три перечисленных механизма резистентности , изложены в таблице. ТИПЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К МЕТИЦИЛЛИНУ(ОКСАЦИЛЛИНУ) У СТАФИЛОКОККОВ Штаммы с классическим типом резистентности могут в свою очередь быть гомо - или гетерогенными по типу экспрессии устойчивости. При гомогенном типе экспрессии практически все микробные клетки проявляют резистентность в стандартных in vitro тестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клеток проявляет резистентность фенотипически . Нередко только 1 из 10–100 млн клеток в популяции с наличием гена mecА экспрессирует резистентность , что обусловливает получение пограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину (МПК – 2–8 мг/л). Резистентность , обусловленная гиперпродукцией b-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, также приводит к получению пограничных значений МПК. Однако резистентность к оксациллину , обусловленная гиперпродукцией b-лактамаз, легко отличается от классической резистентности по ее обратимости при использовании ингибиторов b-лактамаз. В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуценты b-лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.

Наличие классической резистентности наиболее легко определить методом скрининга, так как рост микробных клеток с неклассическими типами резистентности обычно ингибируются . Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности при хранении по сравнению с метициллином . ПРИНЦИП Для идентификации резистентности к оксациллину ( метициллину ) у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий: q NaCl в агар с оксациллином ( pH 7,2–7,4, так как при более низком pH увеличивается число ложноотрицательных результатов); q температура инкубации 35 o С; q длительность инкубации 24 ч для S.aureus и 48 ч – для коагулазоотрицательных стафилококков; q стандартизированное число микроорганизмов. МИКРООРГАНИЗМ Чистая культура Staphylococcus spp ., инкубированная в течение 18–24 ч на кровяном агаре . МАТЕРИАЛЫ Агар Мюллера– Хинтон с добавлением 4% NaCl (4 г на 100 мл среды) и 6 мг/л оксациллина (0,6 мг на 100 мл среды). Агар Мюллера– Хинтон хранится при температуре 2–8oС, готовится согласно прописи на этикетке, 4% NaCl добавляется до автоклавирования.

Субстанция оксациллина с известной активностью предварительно растворяется в стерильной дистиллированной воде (расчет концентрации оксациллина проводят с учетом его активности) и добавляется в охлажденный на водяной бане до 48 –50oС агар Мюллера – Хинтон . Приготовленный агар разливается по чашкам с толщиной слоя 3–4 мм (на чашку диаметром 100 мм – 25 мл). Готовые чашки со средой хранятся в пластиковых пакетах при температуре 4 –8oС не более 5 сут. Для контроля роста необходимо также приготовить чашки с агаром , содержащим 4% NaCl , но без антибиотика.

Кровяной агар с чистой культурой стафилококка, инкубированной в течение 18 –24 ч.

Стерильный физиологический раствор.

Стандарт мутности 0,5 по Мак-Фарланду.

Стерильные тампоны или микропипетка (10 мкл ). Термостат с температурой инкубирования 35 o С. КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера– Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином ). Контрольные штаммы: S.aureus ATCC 38591 – резистентный; S.aureus ATCC 29213 – чувствительный. ПОСТАНОВКА ТЕСТА Приготовление инокулюма . Бактериальную взвесь стафилококка готовят из нескольких колоний с одинаковой морфологией на стерильном физиологическом растворе (3 мл) и доводят до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5·108 КОЕ/мл). Инокуляция. Метод I (микропипеткой): приготовить разведение 1:100 стандартного инокулюма 0,5 по Мак-Фарланду для получения бактериальной взвеси, содержащей 1,5·106 КОЕ/мл (например, добавить 0,1 мл стандартной суспензии к 9,9 мл стерильного физиологического раствора); с помощью микропипетки нанести каплю (10 мкл ) разведенной стандартной суспензии на поверхность агара с оксацил лином . Метод II (с помощью тампона ): погрузить стерильный ватный тампон в пробирку со стандартизированной суспензией (0,5 по Мак-Фарланду ), затем отжать избыток влаги о стенку пробирки; коснуться тампоном поверхности агара с оксациллином . ИНКУБАЦИЯ. Штаммы S.aureus инкубируются при температуре 35oС в течение полных 24 ч, а коагулаза (–) стафилококков – в течение 48 ч.

Примечание. Среда АГВ не может быть рекомендована для постановки теста в связи с высокой частотой ложноположительных результатов. УЧЕТ РЕЗУЛЬТАТА Интерпретация: q появление видимого роста более 1 колонии на месте нанесения культуры означает устойчивость данного штамма к оксациллину ( метициллину ); q при отсутствии роста на месте нанесения культуры исследуемый штамм учитывается как чувствительный к метициллину ( оксациллину ). q при сомнительных результатах, а также для штаммов, выделенных у больных с клинически неэффективной терапией и у больных с серьезными инфекциями, необходимо провести развернутое исследование с определением МПК к оксациллину и гена mecA . Представление результата: q S.aureus или коагулаза (–) стафилококк ( S.epidermidis ), чувствительный к метициллину ( оксациллину ); q S.aureus или коагулаза (–) стафилококк ( S.epidermidis ), резистентный к метициллину (MRSA или MRSE). Метициллино ( оксациллино ) резистентные стафилококки должны расцениваться как резистентные ко всем b-лактамам – пенициллинам, цефалоспоринам , карбапенемам , комбинациям пенициллинов с ингибиторами b-лактамаз. Кроме того, среди метициллинорезистентных стафилококков очень часто наблюдается ассоциированная резистентность к другим антибиотикам – аминогликозидам , макролидам , хинолонам , тетрациклинам. ОГРАНИЧЕНИЯ МЕТОДА Скрининг на агаре с оксациллином предназначен для фенотипического определения штаммов, имеющих ген mecA . Однако штаммы с другими типами резистентности иногда могут давать ложноположительный результат. Метод скрининга для выявления резистентности к оксациллину ( метициллину ) менее надежен у коагулаза (–) стафилококков, чем у S.aureus . Примечание.

Оксациллин в сравнении с метициллином менее стабилен к действию стафилококковых b-лактамаз, что может привести к получению большего числа ложноположительных результатов, чем при использовании метициллина . В то же время метициллин в сравнении с оксациллином значительно менее стабилен при хранении, что и ограничивает его применение. ВАНКОМИЦИНОРЕЗИСТЕНТНЫЙ Staphylococcus aureus О возможности появления ванкомицинорезистентных штаммов S.aureus стали задумываться около 10 лет назад после сообще ний о появлении резистентности к ванкомицину у энтерококков.

Первое сообщение о выделении метициллинорезистентного S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину (МПК 8 мг/л) из клинического материала появилось в 1996 г.

Несмотря на значение МПК к ванкомицину , соответствующее диапазону умеренной резистентности , данный штамм был зарегистрирован как VRSA ( ванкомицинорезистентный S.aureus ) ввиду клинической неэффективности ванкомицина . У этого штамма не было найдено ни одного из ранее известных механизмов резистентности к ванкомицину ; отмечено только увеличение толщины клеточной стенки и концентрации пенициллин-связывающих белков 2 и 2а. Далее одно за другим последовали сообщения о выделении из клинического материала штаммов S.aureus с МПК к ванкомицину 8 мг/л, обозначенных как VISA ( S.aureus со сниженной чувствительностью к ванкомицину ). В результате углубленного исследования ванкомицинорезистентности у MRSA при скрининге более чем 2000 штаммов из различных стационаров было выявлено от 1 до 25%(!) штаммов с гетерогенной ( индуцибельной ) резистентностью к ванкомицину , экспрессирующих ее с частотой около 1 клетки на 1 млн. Такие штаммы могут являться предше ственниками VRSA. Специалисты пока не пришли к согласию, какой термин использовать: VRSA или VISA. Это связано с тем, что, несмотря на значения МПК, соответствующие диапазону умеренной резистентности , налицо клиническая неэффективность ванкомицина при терапии VRSAи VISA-инфекций.

Многие специалисты предлагают свои методы скрининга ванкомицинорезистентности у стафилококков.